【核糖体碰撞-经典研究】 UV致死元凶非DNA损伤？核糖体毒性应激终解密！

导读：

虽然紫外线（UV）辐射会损伤DNA，引发DNA损伤反应（DDR），但它也会损伤RNA，导致整个转录组范围内的核糖体碰撞，并引发核糖体毒性应激反应（RSR）。然而，这些通路在决定细胞命运中的相对作用、发生时序及调控机制仍不清楚。

 

本研究通过对紫外线照射后分子和细胞变化的综合分析表明，核糖体毒性应激反应而非DNA损伤应答介导了紫外线依赖性的程序性细胞死亡。

 

文章索引：

标题：The ribotoxic stress response drives UV-mediated cell death.

发表期刊：Cell.

发表时间：2024.07

作者团队：约翰霍普金斯大学医学院 Rachel Green 团队

IF：42.5

DOI：10.1016/j.cell.2024.05.018.

 

研究结果

（1）对紫外线辐射的即时早期反应主要是由核糖体介导的信号传导

首先，作者通过多组学技术揭示了UV辐射后核糖体介导的信号在早期响应中的主导地位。

示意图（图A）展示了核糖体碰撞激活ZAK和GCN2的分子机制；随后，免疫印迹实验（图B）证实ZAK抑制剂可特异性阻断UV诱导的p38/JNK磷酸化，而GCN2抑制剂则阻断eIF2α磷酸化；活细胞成像（图C）进一步显示UV剂量依赖的细胞命运分化——低剂量诱导G2期阻滞，高剂量触发凋亡；蔗糖梯度离心（图D）直接捕捉到UV照射1分钟内核糖体碰撞体（二聚体/三聚体）的爆发式形成；

 

时间分辨免疫印迹（图E）揭示ZAK-p38-JNK信号级联在5分钟内迅速激活，远早于DDR通路；最后，磷酸化蛋白质组的火山图分析（图F-I）系统描绘了RSR通路激酶的早期主导性激活，其中1分钟即有399个磷酸位点显著变化，且ZAK底物MAP2K4等早于DDR效应分子。

 

 

（2）ZAK和GCN2定义了细胞响应紫外线应激时的早期磷酸化蛋白质组​

接着，作者研究了ZAK和GCN2在紫外线处理后对磷酸化蛋白质组重塑的贡献。紫外线（UV）引发的核糖体毒性应激中，ZAK和GCN2如同细胞信号乐团的指挥。

磷酸化组全景分析（图A-B）发现：ZAK缺失使2487个磷酸位点沉默（占全组10.5%），其中p38/JNK激活环磷酸化完全消失（如MAP2K4-S257/T261），而激酶网络分析（图C-D）进一步证实p38效应器MAPKAPK2/3/5活性暴跌；令人意外的是，GCN2缺失（图E-F）虽使221个磷酸位点下调（如eIF2α-S51），却触发mTOR信号失控——核糖体蛋白RPS6磷酸化异常升高，这种双向失衡（图G-H）最终解释了一个致命循环：当GCN2失效时，翻译过载加剧核糖体碰撞，反而通过激活ZAK-JNK通路将细胞推向凋亡深渊。

 

 

 

（3）细胞对紫外线的反应中，细胞死亡是由ZAK介导的，而不是通过DDR通路

随后，作者发现当紫外线（UV）照射细胞时，ZAK介导的核糖体应激响应（RSR）而非DNA损伤响应（DDR）才是凋亡的真正推手。

 

免疫印迹（图3A）显示ZAK抑制剂选择性阻断p38/JNK磷酸化却不影响CHEK1激活，而ATR抑制剂的作用恰恰相反；这种通路独立性在细胞水平得到印证（图3B）：所有细胞均出现JNK磷酸化（绿色），但仅S期细胞激活CHEK1（红色）。更关键的是，凋亡检测（图3C）证明只有ZAKi能完全挽救UV诱导的死亡，即使联合阻断ATR/ATM也无效；长期培养（图3D）进一步揭示ZAKi赋予细胞显著的增殖优势，而DDR抑制剂反而加剧损伤。最震撼的证据来自p53缺失细胞（图3E-F）：尽管经典凋亡通路被切断，ZAKi仍能完全阻断死亡，证明p53非依赖性凋亡完全由ZAK主导。

（4）GCN2通过限制核糖体负荷来防止ZAK介导的细胞死亡

磷酸化蛋白质组数据对GCN2在核糖体毒性应激中的作用提出了两个有力的预测：（1）GCN2通过磷酸化eIF2α并抑制mTOR活性来阻断翻译起始；（2）在缺乏GCN2的情况下，受损mRNA上翻译起始增加，导致碰撞核糖体的积累并过度激活RSR。

 

预测GCN2的缺失会增加翻译起始，从而导致更多的碰撞。事实上，在UV-C处理后，ΔGCN2细胞中二聚体、三聚体和四聚体的比例增加，同时单体的比例下降（图4A）；那在没有GCN2的情况下，碰撞核糖体的积累是否会通过增加ZAK活性而使RSR过度激活？

 

用UV-C处理MCF10a WT和ΔGCN2细胞，发现在ΔGCN2细胞中，eS10泛素化始终保持升高，表明碰撞核糖体持续积聚（图4B）。p38的激活表现出较温和的增加（图4B）。

 

为了更好地跟踪JNK动态，作者在WT和ΔGCN2细胞中对核毒性应激反应的JNK KTR进行了活单细胞成像。在未经处理的细胞中，JNK KTR主要位于核内，表明基础活性较低。UV-C处理后，JNK-KTR转移到细胞质中，表明活性增加（图4C-D）。JNK活性在20分钟达到峰值，在1小时时下降，然后在几个小时内保持中间脉动状态（图4E）。虽然两种细胞类型表现出相似的JNK动态，但ΔGCN2细胞显示出更高的JNK总体活性。

 

假设ΔGCN2细胞中JNK活性的增加会导致细胞凋亡的增加。作者对WT和ΔGCN2细胞进行了活细胞成像，并测量了紫外线处理后12小时的细胞死亡情况。看到未经处理的细胞几乎没有细胞死亡，紫外处理后WT细胞凋亡百分比略有增加，用ZAKi或JNKi预处理可以逆转这种情况（图4F）。相反，ΔGCN2细胞在UV处理后表现出明显更高的凋亡水平，也被ZAKi或JNKi逆转（图4F）。这些结果支持一个模型，其中GCN2激活限制碰撞核糖体在受损mRNA上的积累，并通过减弱ZAK介导的JNK信号传导来限制细胞凋亡。

 

（5）ZAK自磷酸化调节核糖体解离及其后续降解

当核糖体碰撞激活ZAK时，其C端核糖体结合域（RBR）的⁶⁵⁶DSGFSS⁶⁶¹降解基序成为决定命运的开关——磷酸化组分析（图B-C）发现34个磷酸位点形成三簇动态响应，其中集群2（S587/S660/S668）在UV刺激15分钟达峰并密集包围降解基序（图D箭头）；这触发了分子级联：免疫沉淀质谱（图E）显示碰撞诱导β-TrCP结合暴增，而蔗糖梯度实验（图F）证实集群2磷酸化突变体（S-A）顽固结合核糖体，野生型则快速解离；最终降解路径锁定（图G-K）：CRL1抑制剂MLN4924和蛋白酶体抑制剂硼替佐米完全阻断ZAK降解，但集群2突变体对此无响应，揭示自磷酸化-β-TrCP募集-泛素化降解是ZAK的制动程序。

 

大致形成了如下的机制闭环：

 

 

（6）ZAK降解在持续性核糖体毒性应激条件下限制细胞凋亡并诱导耐受性

作者推测程序化的ZAK降解调控细胞命运，为此系统比较了ZAK磷酸化突变体（Cluster 1/2/3及全突变体）与ΔZAK、野生型（WT）及激酶死亡突变体（K45M, T161A-S165A）的活性（图6A）。关键发现显示：Cluster 2磷酸化位点突变体（S-A）在基础状态下即异常活跃，Phos-tag免疫印迹（图6A，第7/9 vs 第3泳道）证实其迁移率改变，伴随JNK磷酸化显著升高，揭示Cluster 2位点组成性抑制基础核糖体碰撞引发的JNK信号泄露；而UV刺激下，所有突变体的ZAK/p38/JNK磷酸化水平与野生型无差异（图6A），证明激酶结构域（而非磷酸化集群）主导核心应激响应。

 

通过p38/JNK激酶转位报告系统（KTRs）动态监测发现：Cluster 2磷酸化位点突变体（S-A）在核糖体应激下呈现JNK信号持续滞留（野生型呈现脉冲式激活后衰减，而突变体亢进24小时）（图6C）；当细胞经历低剂量ANS预处理时，野生型ZAK通过降解建立耐受态（后续UV刺激无JNK响应），而突变体因降解失灵导致JNK剧烈激活（图6E）；耐受态下的野生型抵抗中剂量UV杀伤（凋亡率＜20%），而突变体因"分子刹车失灵"凋亡率飙升至60%（图6G），长期增殖能力同步崩溃（图6H）。这些证据链共同确证：ZAK降解是细胞应对持续性应激的"分子缓冲器"：其功能完整时，细胞获得修复时间窗；功能缺陷时，则坠入凋亡深渊。

 

研究结论

这项研究揭示出：核糖体碰撞的强度和持续时间充当细胞命运决策的分子调谐器：低水平碰撞（如短暂UV暴露）激活p38通路诱导G2期阻滞，维持稳态；中等水平碰撞触发ZAK自磷酸化降解，建立耐受态以缓冲持续应激；高水平碰撞（如高强度UV）导致ZAK水平激增和JNK持续活化，突破凋亡阈值。这一机制确立ZAK为细胞应激响应的核心剂量传感器，直接将核糖体损伤的动力学转化为生存、耐受或死亡的生物学结局。

 

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