【核糖体碰撞-经典研究】 颠覆认知！免疫系统的“分子刹车”：抗病毒蛋白如何瘫痪病毒工厂

导读：

Viperin作为一种神秘的抗病毒蛋白，能抑制艾滋病毒、寨卡病毒、登革热等数十种致命病毒，却无人知晓其工作原理。

 

本研究发现：Viperin竟能触发细胞内的“交通事故”，让病毒复制机器集体抛锚！这一发现为开发广谱抗病毒药物开辟全新路径。

 

文章索引：

标题：Viperin triggers ribosome collision-dependent translation inhibition to restrict viral replication.

发表期刊：Molecular Cell.

发表时间：2022.05

作者团队：耶鲁大学医学院免疫生物系 Peter Cresswell团队

IF：16.6

DOI：10.1016/j.molcel.2022.02.031.

 

 

研究结果

（1）Viperin抑制病毒翻译

为了测试viperin在病毒复制中的作用，作者构建了一个稳定的293T细胞系，表达Dox诱导的viperin (293T. iVip)（图1A）。viperin显著抑制病毒滴度（图1B），病毒"外壳"E蛋白合成骤减（图1C）。但病毒RNA仅均匀减少（图1D）。

 

病毒RNA和蛋白质水平之间的不平衡表明，viperin可能影响病毒RNA的翻译。为了研究这个问题，作者进行了Polysome分析与qRT-PCR分析，直接监测翻译效率。viperin的表达导致病毒RNA分布从主动翻译多体到单体的剧烈转变（图1E-F）。这表明viperin抑制了ZIKV病毒RNA的翻译。

 

（2）Viperin在I型干扰素反应中抑制宿主翻译​

鉴于viperin具有广泛的抗病毒活性，作者推测viperin可能通过抑制整体翻译而非特异性抑制病毒RNA的翻译来发挥作用。Polysome技术揭示出viperin会引起全局翻译停滞（图2A-B）。

 

O-炔丙基嘌呤霉素（OP-Puro）标记实验显示：高表达Viperin的细胞蛋白合成量骤减，远高于低表达细胞（图2C）。量化证实：Viperin表达量与蛋白合成强负相关（R²=0.66）（图2D）。流式细胞术显示viperin的诱导抑制了细胞蛋白质合成约30%（图2E）。

 

Viperin主要在IFN刺激或病毒感染的细胞中表达。使用OP-Puro标记发现IFN-I刺激以剂量依赖的方式减少了WT 巨噬细胞（iBMDM）中的蛋白质合成，而在VipKO-iBMDM中没有发现减少（图2F-G）。Polysome分析也证实了这一点。这说明数百种干扰素诱导基因中，Viperin是一翻译抑制开关！

 

（3）抗病毒蛋白的“致命漏洞”被发现！

接下来，作者使用突变分析来确定Viperin中负责翻译抑制的关键区域，比如自由基SAM活性。Viperin含有由三个半胱氨酸残基协调的典型所需的[4Fe-4S]簇，将其中两个突变为丙氨酸（DCA，图3A）会导致翻译抑制丧失（图3B）。而如果缺失N端1-42氨基酸的突变体（Δ1-42），虽保留细胞质定位（图3C），但翻译抑制效力减半（图3B）。这些结果通过使用[35S]-蛋氨酸/半胱氨酸代谢标记监测新合成的蛋白质得到证实（图3D）。

 

为了进一步研究自由基SAM活性的作用，作者构建了一个Dox诱导的表达DCA突变体的293T细胞衍生物（293T. iVip^DCA）（图3E）。一致地，诱导WT viperin引起翻译抑制，而诱导DCA突变体则没有（图3F）。

 

 

（4）Viperin产物ddhCTP抑制翻译

已知ddhCTP的合成归因于viperin的自由基SAM酶活性（图4A）。同样的，在可诱导的293T细胞中，野生型viperin（而非酶活性缺失的DCA突变体）能够诱导ddhCTP的合成（图4B）。

 

为了确定ddhCTP是否直接抑制翻译，作者用合成的ddhC核苷处理细胞，该核苷穿过质膜并在细胞质溶胶中转化为ddhCTP。OP-Puro标记发现ddhC处理导致翻译显著减少（图4C）。同时，在多种细胞中进行了ddhC处理和OP-Puro标记分析。观察到ddhC处理抑制了人细胞系（293T和HeLa细胞）、猴成纤维细胞（Vero细胞）和小鼠iBMDM的翻译（图4D-E）。

 

接着，作者评估了ddhCTP的翻译抑制对viperin抗病毒活性的影响。合成ddhC显著抑制ZIKV复制（图4F）。值得注意的是，在ddhC处理的细胞中，病毒蛋白合成显著减少（图4G）。利用荧光素酶报告基因ZIKV，发现ddhC在初始翻译（4和6 hpi）和病毒复制后期（24 hpi）显著抑制ZIKV蛋白合成（图4H）。

 

总的来说，研究结果表明，viperin通过其酶产物ddhCTP抑制细胞和病毒的RNA翻译。

 

（5）Viperin激活了综合应激反应

前文中已知viperin可抑制全局翻译。考虑到IFN-I反应通过综合应激反应（ISR）和mTORC1途径下调全局翻译，作者因此研究了viperin在激活293T.iVip中这些途径的分子成分中的作用。

 

首先，发现viperin诱导eIF2α磷酸化，这是ISR通路激活的标志（图5A）。Dox诱导后3小时，当viperin首次被检测到时，磷酸化是明显的，并在12-24小时达到峰值（图5B）。此外，发现合成的ddhC核苷以剂量依赖性的方式增加了eIF2α的磷酸化（图5C）。

 

鉴于viperin对ISR的激活，那这条通路是否参与了病毒蛋白合成的抑制？viperin的表达抑制ZIKV蛋白的合成（图5D），但这被用ISRIB（ISR抑制剂）所消除。这些结果表明，viperin激活ISR，导致翻译抑制，作为抗病毒机制。

 

ISR的激活会抑制各种细胞应激下的细胞翻译。四种eIF2α激酶，GCN2， PKR， PERK和HRI，作为检测不同细胞应激的传感器。作者发现ddhC以剂量依赖性的方式诱导GCN2的磷酸化，但对其他激酶没有影响（图5E）。GCN2敲除细胞中，ddhC既不能磷酸化eIF2α（图5F），也无法抑制翻译（图5G）。激酶死亡突变体（GCN2-D858N）也丧失功能救援能力（图5H）。这些观察结果支持GCN2在viperin激活ISR中的核心作用。

 

（6）Viperin 引发核糖体碰撞从而激活 ISR

研究表明核糖体碰撞会激活ISR通路中的GCN2。那viperin是否通过诱导核糖体碰撞来激活GCN2？

 

核糖体碰撞可以通过多聚核糖体图谱中disomes的积累直接监测。在表达viperin的细胞中，有一部分核糖体确实能抵抗RNase消化，并以二聚体形式沉淀下来（图6A）。

 

MAPKKK ZAK是一种碰撞核糖体的传感器。作者将核糖体碰撞与GCN2-ISR途径联系起来，并表明碰撞激活了ZAKα亚型的磷酸化（ZAKα）。合成的ddhC核苷酸诱导ZAKα磷酸化，而且该效应被ISRIB增强（图6B）。为了确定ddhC激活ISR是否需要ZAKα，作者构建了ZAK KO 293T细胞系。ddhC处理在对照细胞中诱导了eIF2α和GCN2的磷酸化（图6C），而在ZAK KO细胞中没有观察到这种变化（图6C）。此外，与ZAK在连接viperin诱导的核糖体碰撞和翻译抑制中的关键作用一致，ddhC在缺乏ZAK的细胞中未能抑制翻译（图6D）。

 

（7）Viperin通过核糖体碰撞依赖的翻译抑制来限制病毒复制

最后，作者阐释了viperin抗病毒活性的机制。293T.iVip细胞中viperin显著降低了西尼罗河病毒昆津株（WNV_KUNV）的复制（图7A）。而且，表达viperin的细胞在24 hpi时降低了约80%（图7B），而病毒RNA水平仅中度减弱（图7C）。

 

接下来，作者研究了GCN2和ZAK在ddhC治疗中抑制WNV_KUNV复制是否必要。首先，ddhC在对照细胞中显著抑制WNV_KUNV的复制，类似于对ZIKV复制的影响。然而，ddhC在缺乏GCN2或ZAK的细胞中未能抑制病毒复制（图7D）。其次，ddhC在对照细胞中降低了WNV_KUNV病毒蛋白的表达，但在GCN2 KO细胞中没有降低WNV_KUNV病毒蛋白的表达（图7E）。

 

总之，这些结果支持了一个模型，即viperin通过核糖体碰撞触发ISR来抑制病毒复制。

 

 

 

研究结论

Viperin是一种广谱抗病毒蛋白，通过限制病毒蛋白的产生来抑制两种医学上相关的病毒复制。Viperin合成的核苷衍生物ddhCTP可诱导核糖体碰撞，从而激活综合应激反应，从而抑制翻译。

 

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