【核糖体蛋白调控翻译】 | 精度调节器：核糖体蛋白uS11/Rps14如何掌控起始密码子的“识别天平”

导读：

在蛋白质合成的起始阶段，细胞必须精准识别起始密码子（如AUG），以确保翻译的正确性。一旦识别错误，可能导致蛋白质功能异常或疾病。

 

近期，一项发表于《核酸研究》的研究深入解析了核糖体小亚基蛋白uS11/Rps14（又名Rps14）如何通过与rRNA和mRNA的动态相互作用，充当“分子开关”调节翻译起始复合物（PIC）的构象变化，从而影响起始密码子识别的准确性。这项研究不仅揭示了翻译调控的新层，还为理解相关疾病（如癌症和遗传病）提供了分子基础。

 

文章索引：

标题：Distinct uS11/Rps14 interactions with the translation preinitiation complex differentially alter the accuracy of start codon recognition.

发表期刊：Nucleic Acids Research.

发表时间：2025.03

作者团队： 美国国立卫生研究院 Alan Hinnebusch团队

IF：13.1

DOI：10.1093/nar/gkaf163.

 

名词注释：

Sui-表型：起始密码子突变的抑制子表型，指某些突变能够“抑制”起始密码子突变带来的缺陷；

Ssu-表型：Sui-的抑制子表型，指某些突变能够抑制Sui-表型，即恢复对AUG密码子的偏好，提高翻译 fidelity。

His+表型：源于Sui-突变允许在his4-301基因的UUG起始密码子处起始翻译，合成组氨酸生物合成酶

 

研究结果

（1）uS11/Rps14在Py48S PIC的开放和封闭构象中的位置

作者通过结构模型对比了酵母48S预起始复合物（PIC，图1A）的开放和闭合构象中uS11/Rps14的位置与相互作用（图1B）。

 

在开放状态，uS11/Rps14-L137优先与rRNA残基G904（距离5.8 Å）和mRNA骨架 near -3 nucleotide（距离6.3 Å）相互作用，而R135和R136与rRNA骨架段相互作用（距离分别为5.9 Å和4.6 Å）；

在闭合状态，rRNA-G904直接接触mRNA的-3 context nucleotide（距离2.9 Å），L137转而与mRNA磷酸二酯骨架更紧密结合（距离4.6 Å），且R135和R136更接近rRNA（距离4.0 Å和3.4 Å），揭示构象切换中相互作用重塑以精细调控起始密码子识别。

 

（2）uS11/Rps14残基L137的替换显著增加UUG起始密码子的利用​

随后，作者通过体内实验系统评估了uS11/Rps14残基L137替换对起始密码子识别准确性的影响。

 

 

观察菌株JVY10在葡萄糖或半乳糖培养基上的生长情况，显示RPS14A缺失导致生长缺陷，但被WT RPS14A回补（图2A）。在his4-301背景菌株JVY10中，L137替换（如L137A、L137E、L137R）不影响基本生长（图2B），但显著增加UUG起始密码子的利用，表现为UUG:AUG报告基因表达比率升高（图2C），证实Sui-表型；然而，这些突变单独不引发His+表型（图2B），表明不足以抑制组氨酸缺陷。

 

在SUI3-2（eIF2β突变）背景下，L137突变协同增强His+表型（图2D）和UUG起始（图2E），但GCN4-lacZ assay显示无Gcd-表型（图2F），提示L137特异性促进闭合构象转换而不影响TC加载。综上，揭示L137通过稳定开放构象阻止错误起始，其替换破坏此功能，导致UUG识别增加。

 

（3）uS11/Rps14-L137替换减少对poor context AUG 的选择性​

随后，作者通过多实验验证uS11/Rps14-L137替换突变（如L137E和L137R）降低对poor context AUG的选择性。

 

Western blot显示eIF1蛋白表达显著增加（图3A），表明SUI1基因（AUG上下文劣质）翻译增强；SUI1-lacZ报告基因实验证实天然CGU表达升高而优化AAA表达变化较小，导致表达比率降低（图3B）；

 

GCN4-lacZ实验进一步揭示在在poor context uAUG-1处，下游ORF表达升高（图3C），整体证明L137突变促进劣质位点起始。​

 

（4）uS11/Rps14-L137E在体外稳定UUG密码子处的闭合/PIN构象​

然后，作者通过体外生化实验证实uS11/Rps14-L137E突变稳定48S预起始复合物（PIC）在UUG密码子处的闭合/PIN构象。

 

 

Polysome profiling分析显示L137E突变不影响整体翻译效率（多核糖体/单核糖体比率无显著差异）（图4A）；利用电泳迁移变动分析（EMSA）测量三元复合物（TC）解离动力学（图4B），发现L137E突变40S亚基显著降低TC从UUG-mRNA复合物的解离速率，并增加超稳定复合物的形成（终点值升高），而对于AUG-mRNA复合物影响较小（图4C-E），表明L137E通过促进PIN状态转换增强UUG起始，与体内Sui-表型一致。

 

（5）uS11/Rps14 R135和R136的替换降低了对UUG起始密码子的选择性

体内点板实验和报告基因分析证实，uS11/Rps14的R135和R136替换（如R135E和R136E）显著降低了对UUG起始密码子的选择性。

 

 

利用JVY10菌株的转化子，带有指示的RPS14A等位基因或空载体，进行点板实验（图5A）。在JVY10菌株中，这些突变体在含SUI5（eIF5突变）背景下抑制了UUG起始介导的His+表型（图5B），并降低HIS4-lacZ报告基因的UUG:AUG表达比率（图5C），而不影响AUG起始效率，表明突变通过 destabilize 闭合构象提高起始准确性，与Ssu-表型一致。

 

（6）uS11/Rps14-R135和-R136替换降低了对poor context AUG的选择​

多实验验证uS11/Rps14的R135和R136替换突变（如R135E、R136E）显著降低了对poor context AUG的选择：Western blot分析显示突变体降低eIF1蛋白表达（图6A-B），表明SUI1基因（poor context AUG）翻译减少；SUI1-lacZ报告基因实验证实天然poor context（-3CGU-1）表达显著降低而优化context（-3AAA-1）表达变化较小，导致表达比率下降（图6C）；GCN4-lacZ实验进一步揭示在poor context uAUG-1处，下游ORF表达升高（图6D-E），整体证明这些突变通过去稳定闭合构象提高起始准确性，与Ssu-表型一致。

 

 

（7）uS11/Rps14-R135E在体外减少PIN状态Met-tRNAi容纳​

体外多聚核糖体分析和TC解离动力学实验证实uS11/Rps14-R135E突变 使得闭合/PIN构象不稳定。Polysome profiling分析显示Rps14-R135E突变导致多聚体显著减少，而对40S亚基丰度的影响相对较小（图7A），TC解离实验揭示R135E显著增加三元复合物（TC）从AUG和UUG起始复合物的解离速率并降低超稳定复合物形成（终点值减少），尤其对UUG复合物影响更显著（图7B-D），表明突变通过减少Met-tRNAi在PIN状态的容纳，增强起始准确性，与体内Ssu-表型一致。

 

（8）uS11/Rps14残基在调节预起始复合物（PIC）从开放到闭合构象转换中的不同作用

最后，结构模型揭示了uS11/Rps14残基在调控预起始复合物（PIC）构象切换中的双重作用；

 

该机制类似于eIF1A的SE/SI元件功能，整体凸显uS11/Rps14通过动态相互作用精细调控起始密码子识别的准确性。​

 

 

研究结论

这项研究首次阐明uS11/Rps14作为翻译起始的“分子精度调节器”，通过残基特异性相互作用调控PIC构象切换，确保起始密码子识别的准确性。

 

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