【RBP调控翻译】 | 细菌翻译“交通警”YebC：专治核糖体“脯氨酸拥堵”

导读：

在细菌蛋白质合成过程中，连续脯氨酸（Pro）序列如同危险的多发事故路段，极易引起核糖体“追尾停滞”（Ribosome Stalling），导致翻译中断。已知的救援因子EF-P和ABC蛋白（如YfmR）虽能部分缓解拥堵，但许多细菌仍存在未知机制。

 

本研究通过系统性筛选化脓性链球菌（S. pyogenes）的RNA结合蛋白（RBP），发现一个高度保守的蛋白YebC能特异性识别核糖体肽基转移酶中心（PTC），高效解除脯氨酸富集序列（如P5、PIP、PPG）引起的翻译阻塞。这一发现不仅揭示了细菌翻译调控的新层，更为理解核糖体病理性停滞提供了关键分子工具。

 

文章索引：

标题：RNA-binding protein YebC enhances translation of proline-rich amino acid stretches in bacteria.

发表期刊：Nature Communications.

发表时间：2025.07

作者团队：德国马克斯-普朗克研究所 Emmanuelle Charpentier团队

IF：15.7

DOI：10.1038/s41467-025-60687-4.

 

翻译组学技术的核心作用：​​

本研究成功运用多项翻译组学前沿技术解析YebC功能：

(1) Ribosome Profiling：通过27-40 nt核糖体保护片段测序，单密码子分辨率定位停滞位点。

(2) Polysome profiling：通过蔗糖梯度离心分析WT、ΔyebC和回补菌株的核糖体分布，表明YebC缺失不改变整体翻译起始或核糖体组装效率。

 

研究结果

（1）UV介导的RNA-蛋白交联鉴定化脓性葡萄球菌中的RBP

首先，作者系统鉴定了化脓性链球菌中的RNA结合蛋白（RBPs）：通过UV 254 nm交联捕获蛋白-RNA复合物，经酸胍硫氰酸盐-酚-氯*仿提取分离后，利用OOPS（正交有机相分离）或RBS-ID技术进行分析（图1a）。

 

Venn图显示注释的RBPs、显著OOPS富集的蛋白及RBS-ID鉴定的交联位点蛋白之间存在高度重叠，验证了方法的可靠性（图1b）。功能组分析进一步揭示不同类别RBPs（如RNA代谢、翻译相关蛋白）的OOPS富集值分布和交联位点存在差异，蜂群图显示富集强度，条形图统计各功能组中具交联位点的蛋白数量（图1c）。

 

（2）RBP候选者在化脓性链球菌中的特征验证与YebC蛋白分析​​

随后，作者通过多维度验证化脓性链球菌中RNA结合蛋白（RBP）候选者：​​

手动策划的功能类别显示候选蛋白涵盖DNA结合、代谢酶及未知功能组（图2a）；UV交联与免疫沉淀-放射性标记实验证实YebC和YjbK强结合RNA（类似阳性对照YhaM），Western blot验证了特异性（图2b）；特性描述包括OOPS富集值（如YebC log2=1.199）、功能域及交联位点定位（图2c）；YebC亚型分析揭示细菌特异性分布（如S. pyogenes仅编码YebC_II）（图2d）；结构建模显示YebC正电荷表面（域I/II）介导RNA互作，关键交联位点（如Y84）位于活性界面（图2e）。

 

 

（3）YebC缺失在化脓性链球菌中引起多层面表型缺陷

接着，作者研究了YebC基因缺失在化脓性链球菌（S. pyogenes）中的表型效应，通过多组实验验证YebC蛋白在细菌生长、毒力因子表达和宿主免疫应答中的功能。

 

具体来看，生长曲线显示ΔyebC在CDM培养基中静止期密度增加（图3a）；Western blot证实SpeB蛋白酶成熟受阻（仅见酶原，图3b）；报告基因实验表明speB启动子活性降低（图3c）；巨噬细胞感染模型中生存能力显著下降，回补菌株部分挽救表型，证明YebC通过调控毒力因子表达和宿主适应影响细菌致病性（图3d）。​

 

（4）鉴定YebC活性的关键氨基酸残基

作者通过定点诱变和功能分析，鉴定了YebC蛋白中关键氨基酸残基对其活性的影响，系统性地验证了YebC的RNA结合功能及其在细菌生理中的作用。

 

首先，通过将定点诱变的氨基酸残基叠加到YebC蛋白结构模型上，识别出可能参与RNA互作的关键区域（图4a）。这些残基包括正电荷表面斑块（如域I和II的保守氨基酸）和负电荷区域（如域III），其中酪氨酸Y84被特别关注，因为它是一个RNA交联位点，且高度保守。

 

其次，在CDM培养基中，测量了yebC突变体和回补菌株的静止期光密度（图4b）。数据显示，ΔyebC菌株的光密度显著高于野生型（WT）（p < 0.05），而回补野生型yebC（带C端3xFLAG标签）可恢复表型。Western blot验证了回补菌株中YebC蛋白的表达水平。一些突变体（如M2和Y84A）无法回补表型，表明这些突变破坏了YebC功能。

 

 

同时，检测了yebC突变体和回补菌株中SpeB蛋白酶的表达（图4c）。在ΔyebC菌株中，SpeB主要以酶原（40 kDa）和中间体形式存在，成熟形式（28 kDa）减少；回补野生型yebC可恢复SpeB成熟。表明YebC通过调控SpeB加工或表达影响毒力。

 

最后，使用OOPS技术富集RNA结合蛋白（RBP）组分，并通过Western blot检测YebC及其突变体（M2和Y84A）的量（图4d）。在ΔyebC菌株中回补野生型或突变型yebC，UV交联后，发现突变体M2和Y84A在RBP富集组分中的量显著低于野生型YebC（p < 0.05），表明这些突变削弱了YebC与RNA的结合能力。

 

（5）YebC与核糖体的相互作用

接下来，作者通过多种实验方法揭示了YebC蛋白与核糖体的特异性相互作用，重点展示了YebC在23S rRNA上的结合位点及其功能影响。

 

首先，作者通过分析YebC交联的核苷酸在化脓性链球菌转录组中的分布，确定了30nt长度的基因组区域中交联核苷酸数量显著增加的区域（图5a），并突出了每个文库中的顶部交联区域（top CL region），表明YebC优先结合特定RNA位点。

 

其次，使用iCLIP技术分析yebC::3xFLAG菌株在UV交联后的23S rRNA覆盖情况，数据显示在核苷酸2440至2470区域（位于23S rRNA domain V）有显著富集（图5b）。

 

然后，详细展示了23S rRNA domain V中交联区域的位置（图5c），蓝色圆圈标识iCLIP读取覆盖增加的核苷酸，红色圆圈标识直接交联的核苷酸（如A2453、A2454和A2456），并与E. coli同源核苷酸（A2450、A2451和A2453）进行对比，显示进化保守性。基于E. coli核糖体结构（PDB ID 7KOO），通过透明和横截面视图展示50S亚基中helix 89（蓝色）的位置（图5d），关键核苷酸A2450、A2451和A2452（红色高亮）位于肽基转移酶中心（PTC），并与P-tRNA（淡紫色）和A-tRNA（绿色）相邻，30S亚基以黄色显示，表明YebC可能通过结合PTC附近区域影响翻译。

 

最后，作者比较WT、ΔyebC和回补菌株（ΔyebC/yebC+）的多聚核糖体图谱（图5e），显示yebC缺失不影响多聚核糖体分布或核糖体组装，表明YebC与核糖体的相互作用是瞬时的而非稳定结合，可能仅在翻译过程中临时招募。

 

（6）yebC突变体中的核糖体暂停分析

基于上述结果，作者同时通过Ribo-seq技术中的核糖体暂停评分（pause score）分析，系统性地研究了YebC功能缺失对化脓性链球菌翻译过程的影响，揭示了YebC在缓解脯氨酸富集序列引起的核糖体停滞中的关键作用。

 

首先，比较了野生型（WT）和yebC突变体（包括ΔyebC和功能失活突变体）在valS基因密码子27-66区域的核糖体暂停分数（图6a）。数据显示，yebC突变体中多个密码子的暂停分数显著升高，峰值出现在脯氨酸密码子附近，表明YebC缺失导致翻译效率降低。

 

其次，使用Logo图可视化yebC突变体中暂停增加位点附近的密码子分布（图6b）。显示暂停集中发生在脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）密码子下游，提示这些氨基酸的连续序列（如PP或DP motifs）可能引发几何障碍，阻碍肽键形成。

 

然后，鉴定出在yebC突变体中显著富集的氨基酸基序，包括PPG、PIP和DIP（图6c）。这些基序均包含脯氨酸残基，且在多肽链中形成刚性结构，导致核糖体易发生碰撞和暂停。

 

最后，量化PPG、PIP和DIP基序周围的平均暂停分数（图6d）。在yebC突变体中，PPG基序的暂停分数最高，且暂停持续到基序下游3个密码子；PIP和DIP基序也显示中度暂停。基序在S. pyogenes转录组中的出现频率（PPG: 高频, PIP/DIP: 中频）与暂停强度相关，证明YebC通过解除脯氨酸序列的翻译停滞优化全局翻译效率。

 

（7）YebC对产化脓链球菌脯氨酸富集区翻译的影响

最后，作者通过体内报告基因和蛋白质组学分析证实YebC缺失导致多脯氨酸序列翻译停滞和蛋白表达下调：​​

 

在ΔyebC菌株中，携带P5或P3脯氨酸富集序列的报告蛋白出现显著翻译停滞（Western blot检测到截断产物），全长蛋白表达量降至对照的40-60%，而PPG和PIP序列影响较弱（图7a）。

 

蛋白质组学数据揭示（图7b），具有YebC依赖性核糖体暂停位点的基因（69个）在ΔyebC中对数期表达显著降低，而无暂停位点基因（1246个）未受影响，表明YebC通过缓解脯氨酸诱导的翻译阻塞维持全局蛋白稳态。

 

（8）YebC同源物的活性

YebC旁系同源物（如YeeN和YebC）在体外能缓解多脯氨酸引起的翻译停滞，而体内实验显示yebC缺失在EF-P缺陷背景下导致生长严重受损，证明YebC与EF-P协同维持翻译效率，且亚型间功能分化。

 

 

研究结论

这项研究揭示出：

ü 机制创新：YebC代表一类新型翻译辅助因子，通过直接结合核糖体PTC，促进脯氨酸富集序列的肽键形成，与EF-P和ABC蛋白形成三重保障机制。

ü 进化启示：YebC在细菌中广泛存在（分I/II亚型），其线粒体同源物TACO1已知调控COX1翻译，提示从细菌到真核生物的翻译调控保守性。

应用前景：靶向YebC或可开发新型抗菌策略（尤其针对毒力因子表达）。为核糖体停滞相关疾病（如线粒体病）提供分子干预新靶点。

 

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