导读
人类基因组中存在着数千个具有编码小肽（＜100个氨基酸）潜力的小型开放阅读框(smORFs)。然而，实际翻译的smORFs数量及其分子和功能作用尚不清楚。
本研究中，作者通过对果蝇的多聚体（Polysome）部分进行核糖体分析（ribo-seq）,从全基因组水平对smORFs翻译进行了评估。作者检测到两种类型的smORFs结合多个核糖体，从而进行活跃性翻译：

1. “较长”smORFs大约编码80个氨基酸，在翻译度量和保守性方面类似于典型蛋白，并且可能包含跨膜基序；
2. “较短”smORFs通常编码约20个氨基酸，主要存在于5'UTR和非编码RNA中，保守性较差，且没有肽功能。

本研究表明：数千个smORFs在后生动物基因组中被翻译，它们是基因组中一类丰富且基本的组成原件。

文章索引
标题：Extensive translation of small Open Reading Frames revealed by Poly-Ribo-Seq
发表期刊：eLife
发表时间：2014.08
作者团队：英国苏塞克斯大学生命科学学院Juan-Pablo Couso团队
IF：7.7/Q1
DOI：10.7554/eLife.03528.

研究概览


研究结果

果蝇基因组的注释中，预测smORFs编码基因的比例是其他后生动物基因组的两倍(约829个smORFs基因，占总数的4%)。但只有164个带注释的smORFs具有以下表明翻译或肽功能的特征：(1)GO分析表明其具有蛋白质功能；(2)与蛋白质组学实验中的肽匹配；(3)编码序列具有保守性(图1A)。


 

1. “Poly-Ribo-Seq”技术：多聚体（Polysome）组分的核糖体分析

本研究中，作者采用了“Poly-Ribo-Seq”技术(图1B)：首先通过polysome profiling技术分离出由多个核糖体结合并因此被主动翻译的mRNA（即Polysome组分），并将其与非生产性80S核糖体结合的mRNA区分开来，再对Polysome结合的RNA进行核糖体分析（ribosome-seq）。该技术可确保分析的RNA有核糖体足迹发生时，其正在进行主动翻译。

为了特异性地富集活性翻译含有单个smORFs的mRNA，作者考虑到了smORFs的有限长度(≤303 nt)可结合核糖体的特点。据报道，1个核糖体占据80 nt。因此在smORFs上，核糖体的最大数量为5(起始密码子上一个，每80 nt一个)。qPCR证实：与large polysome相比，small polysome中的smORFs mRNA更丰富(补充图1A)，但这表明果蝇的smORFs可以被多达6个核糖体结合，这可能反映了核糖体更紧密的分布。

因此，作者选择分离Fraction 2-6以富集smORFs。这些small polysome也可以结合典型的较长ORF的mRNA，这些ORF不会被核糖体完全覆盖，因此翻译的水平低于最高水平(补充图2)。


作者分别对large polysome和small polysome部分进行核糖体分析，并将胞质mRNA进行RNA-seq作为对照。分析显示：Poly-ribo-seq捕获了活跃翻译区域，因为约80%的reads映射到典型蛋白质编码基因的编码序列，读取密度在起始密码子之前和终止密码子之后下降(图1C)。


作者还分析了翻译效率(TE，即核糖体足迹的RPKM /总mRNA的RPKM）。与5'-和3'-UTR相比，CDSs中所有带注释的蛋白质编码转录本的TE中位数明显更高(图1D)，这表明“Poly-Ribo-Seq”定义了活性翻译区域。

 

1. Poly-Ribo-Seq检测smORFs翻译

Large polysome和small polysome在全基因组核糖体密度上存在显著差异(图2A)，这表明这两个部分含有不同水平翻译的mRNA。Poly-Ribo-Seq检测到具有翻译特征的smORFs，这些smORFs在small polysome中富集，其包含的smORFs数量是large polysome中检测到的两倍(图2C)。

在第一次的Poly-Ribo-Seq实验中，共有191个带注释的smORFs被认为是翻译的。占S2细胞中转录的smORFs的约70%(图2D)。随后，作者对small polysome进行了重复实验，检测到224个smORFs的翻译(图2D)。因而，两次实验共检测到227个smORFs的翻译，占S2细胞中转录smORFs的83%(图2E)。在两个独立的Poly-Ribo-Seq实验中，核糖体密度的全基因组分布是强相关的(R²= 0.83)，这表明Poly-Ribo-Seq具有很高的可重复性(图2B)。

第三次重复实验中，作者加入了去除rRNA的处理，因此增加了检测到的ORF总数，但只将推定翻译的smORFs数量增加了一个(图2D)。三个独立实验的结果高度重叠(图2D)。这些数据表明：在S2细胞中转录的274个smORFs中，有228个被翻译(83%)，这与标准长度蛋白质编码ORF的翻译比例(81%)非常相似(图2E)。

 

1. smORFs翻译的验证

作者还将上述结果与肽组学数据进行了比较。Poly-Ribo-Seq将S2细胞中具有翻译证据的smORFs数量增加了近4倍，从59个(Peptide Atlas)增加到228 (Poly-Ribo-Seq)。Poly-Ribo-Seq在S2细胞中检测到86%具有肽图谱证据的smORFs(59个smORFs中有51个；图2F)。

检测小肽需要特定的肽组学方法。作者对S2细胞中大小为5-15 KDa的小蛋白进行质谱分析，以寻找smORFs肽（45-130 aa）。共检测到60个带注释的smORFs肽，其中40个在Peptide Atlas S2数据集中未检测到(图2F)。

接着，作者进行了肽标记转染实验。将smORFs编码序列的C端带上去掉了起始密码子的FLAG标记，因此任何FLAG信号都是smORFs翻译的结果。


转染S2细胞后，观察到12个smORFs的翻译，它们表现出一系列的翻译指标(图3A-B)。标记肽表现出不同的亚细胞定位，这表明不同的肽功能(图3A-B）。


 

1. smORFs的其他来源

作者还关注了未注释的smORFs如ncRNA smORFs。Poly-Ribo-Seq数据显示存在相当一部分(34%)的非编码RNA smORFs存在翻译(图2E)，部分可以显示FLAG和Western blot信号，类似于带注释的smORFs(图3C）。因此，在S2细胞中，所谓的非编码RNA基因中有一部分实际上包含被积极翻译的smORFs。

另外，还有上游短ORF (uORF)。作者在28,529个FlyBase注释转录本的11,587个5'UTR中鉴定出14,881个带有AUG起始密码子的uORF。其中9069个uORF在S2细胞中被转录，其中2708个(30%)被核糖体覆盖(图2E)。但它们编码肽的丰度较低。然而，uORF的标记偶尔会显示出与已标注的smORFs相似的信号(图3D）。
 

1. 翻译smORFs的生物信息学分析揭示了其特定的特征

最后，作者分析了基因间区序列和典型长蛋白编码序列的phastCons值(图4A)，并获得了区分阈值0.55 (10% FDR)。93%的S2翻译的smORFs的phastCons得分高于这个阈值(中位数= 0.66)，表明其保守水平与规范的长ORF相似，因此与编码序列的功能水平相似。

进一步地，作者研究了翻译后的smORFs的氨基酸组成，与常规长蛋白和氨基酸随机使用进行了比较(图4B)。注释的smORFs显示精氨酸的使用低于随机使用，也显示出几种氨基酸的不同使用，如富含赖氨酸和苯丙氨酸，而缺乏丝氨酸(图4B）。这些氨基酸是典型蛋白质中α -螺旋的特征。在翻译smORFs(图4C)和所有预测的smORFs中(图4D)均大约三分之一存有大量假定的跨膜α-螺旋基序。

Poly-Ribo-Seq检测到的翻译smORFs的生物信息学特征，包括：氨基酸用量(图4B)、推测的跨膜α -螺旋的丰度(图4C-D)和平均肽长度(图4E-F)。

由于uORF和ncRNA编码的肽在生物信息学上与smORFs和标准长CDS不同，因此暂时没有指标能够将翻译的uORF和ncRNA与基因间序列或随机序列区分开来。

因此，Poly-Ribo-Seq应该可以检测两种类型的smORFs的翻译：

• “较长”的smORFs，可以有效地翻译产生具有肽功能生物信息学标志的80个氨基酸；
• 从ncRNA和5 'UTR翻译而来的“短”smORFs，它们通常较短(~ 20aa)，翻译效率较低，并且缺少此类生物信息学和分子标记。

研究结论
本研究表明：数千个smORFs在后生动物基因组中被翻译。而且，存在两种类型的翻译smORFs。“较长”的smORFs产生保守的80个氨基酸长的肽，其翻译效率类似于典型蛋白，其功能倾向于与细胞膜相关。“较短”smORFs主要存在于5'UTR和非编码RNA中，基因预测程序无法检测到，平均编码约20 aa长的肽。它们也不太保守，翻译效率较低，功能尚不清楚。


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