导读：
mRNA翻译和细胞呼吸之间存在复杂相互作用，但其在人类健康或疾病中的调节尚不清楚。癌细胞可重塑生物合成和生物能量途径，以维持其异常的生长速度。

线粒体伴侣蛋白TRAP1是HSP90蛋白家族的主要线粒体成员，在线粒体中与呼吸复合物相互作用，有助于调节癌细胞的细胞呼吸。此外，这种蛋白质也部分定位于内质网的外侧，通过与翻译相关成分结合参与蛋白质合成的调节。


本研究即阐释了其中所涉及的分子机制，表明TRAP1：

1. 结合线粒体和细胞质核糖体，以及翻译延伸因子;
2. 减缓翻译延伸率;
3. 有利于线粒体局部翻译（localized translation）。

总之，本研究显示：癌细胞代谢调节的复杂性达到了高水平，基于单个分子伴侣在线粒体和细胞质翻译以及线粒体呼吸中都起作用的证据，强烈表明蛋白质合成和能量代谢之间存在紧密的反馈回路。

文章索引
标题：Cytosolic and mitochondrial translation elongation are coordinated through the molecular chaperone TRAP1 for the synthesis and import of mitochondrial proteins.
发表期刊：Genome Research
发表时间：2023.08
作者及团队：意大利那不勒斯菲里德里克第二大学Danilo Swann Matassa团队
IF：7
DOI：10.1101/gr.277755.123.

研究思路

研究结果
（1）TRAP1与细胞质和线粒体蛋白合成机器有关
首先，作者通过Polysome profiling分析表征了TRAP1与HeLa细胞翻译机器的关联，结果显示，至少0.7±0.33%的总TRAP1存在于Polysome部分(图1A)。用翻译起始抑制剂Harringtonine处理，可大大减少polysome组分，TRAP1也因此检测不到(图1B)。这一结果证实了TRAP1的存在与活跃翻译多聚核糖体的存在有关。



另外，作者发现TRAP1蛋白的主要线粒体定位(图1C)。因此想验证TRAP1是否也与线粒体翻译机器相互作用。从HeLa细胞中分离线粒体核糖体，并进行蔗糖溶液梯度离心，WB显示线粒体核糖体中存在TRAP1、线粒体核糖体蛋白MRPS5和线粒体翻译延伸因子TUFM。与TRAP1高度同源的分子伴侣HSP90AA1也存在于癌细胞线粒体中(图1C-D)。

此外，作者在HeLa细胞中使用针对TRAP1和线粒体核糖体蛋白MRPL12的抗体进行了PLA实验。结果显示：TRAP1在HeLa细胞中与线粒体核糖体结合(图1E)。

（2）TRAP1调节细胞质和线粒体中的蛋白质合成
为了阐明TRAP1对蛋白质合成调控的分子机制，作者在HeLa细胞中研究了其功能。与未融合的GFP表达细胞相比，TRAP1沉默导致³⁵S Met/³⁵S Cys掺入（表征细胞总蛋白合成率）增加，而TRAP1-GFP过表达导致掺入减少(图2A)。

考虑TRAP1主要定位于线粒体(图1C），作者通过使用线粒体特异性FUNCAT (mito-FUNCAT)检测进一步表征了其在全细胞线粒体翻译中的调节作用。结果表明，在线粒体编码蛋白中，氨基酸类似物L-homopropargylglycine (HPG)的掺入不受TRAP1沉默或过表达的影响(图2B）；RT-qPCR显示，TRAP1沉默减少了线粒体编码转录物与线粒体核糖体的关联(图2C)，表明翻译减少。

为了进一步表征TRAP1对翻译的影响，作者评估了在体外系统中添加5'甲基鸟苷帽子后，TRAP1对mRNA翻译的贡献。如图2E所示。在小麦胚芽提取物中加入成熟的重组TRAP1蛋白，当转录物中加入5'甲基鸟苷帽时，减少了体外转录的GFP mRNA的翻译，但增加了未加帽的mRNA的翻译。

这一结果支持了TRAP1在翻译中的直接作用。此外，考虑到线粒体和原核翻译之间的相似性，添加TRAP1增加了大肠杆菌提取物中GFP报告蛋白的合成(图2F)。

（3）TRAP1与线粒体蛋白输入机制相关，以支持局部翻译
PLA和Co-IP实验证实了TRAP1蛋白与线粒体蛋白质输入通道组分TOMM40的特异性结合（图3A-B）。而且，TRAP1也与定位于基质中的线粒体蛋白相互作用，如线粒体翻译延伸因子TUFM(图3C)。

鉴于TRAP1与细胞质和线粒体翻译因子以及核糖体、蛋白质进口通道组分的结合，作者评估了这些相互作用是否依赖于活性蛋白质合成。分别用特异性抑制剂处理细胞：Harringtonine--抑制细胞质翻译起始、Emetine--抑制胞质翻译延伸、Linezolid--抑制线粒体翻译起始、Chloramphenicol-抑制线粒体翻译延伸。Co-IP显示，抑制胞质蛋白合成显著降低了TRAP1和TOMM40之间的结合，而TRAP1-EEF1A1和TRAP1-TUFM的相互作用增加(图3D)。相反，抑制线粒体翻译对细胞质或线粒体伴侣的结合没有影响(图3E)。

该结果证实了该过程的单向性:即细胞质翻译将信号转导到线粒体翻译装置，而线粒体翻译无法将信号逆转到细胞质核糖体。TRAP1参与了这种单向机制。

使用PLA来评估TRAP1是否可能同时参与线粒体蛋白的输入和局部蛋白合成。结果表明，通过核糖体蛋白RPS6的磷酸化检测，TRAP1-GFP在HeLa细胞中的诱导增加了TOMM20与主动翻译核糖体之间的近距离连接点的数量(图3F)。
此外，发现TRAP1确实定位于所谓的线粒体相关膜(MAMs)，这是内质网和线粒体物理连接的所有细胞共有的区域(图3G)。
总之，TRAP1与这些结构物理关联的发现为之前描述的TRAP1在脂质生物合成、钙和内质网稳态中的功能提供了进一步的支持。
 

1. TRAP1调控翻译延伸

首先通过荧光寿命成像(FLIM)证明TRAP1在HeLa细胞中直接与翻译延伸因子EEF1G结合，从而也证实了TRAP1在细胞质室中的存在及其与细胞质翻译机制的关联(图4A)。另外，也发现在HeLa TRAP1-GFP细胞中TRAP1直接结合线粒体翻译延伸因子TUFM（图4B）。在停流实验中，TRAP1抑制了70S起始复合物(70SIC)中EF-Tu的释放（图4C）。


那这种机制是否反映了翻译延伸的变化？Harringtonine抑制翻译起始后，不同的时间间隔测量嘌呤霉素在新生肽链中的掺入。与shGFP对照相比，在TRAP1敲低的细胞中，经Harringtonine处理后，嘌呤霉素标记的衰减更陡峭(图4D)，衰减速率常数显著降低。

这表明，在没有TRAP1的情况下，核糖体沿着mRNA移动速度更快，因此翻译延伸率增加。因此，与对照ACTIN-FLAG细胞相比，用Harringtonine处理2分钟后，TRAP1-FLAG过表达细胞中的Polysome减少较少，Monosome增加(图5A)，而与shGFP对照相比，shTRAP1细胞的核糖体流失速度更快(图5B)。

对照和shTRAP1 HeLa细胞用Harringtonine处理2分钟并分离，用qPCR方法估计处理和未处理细胞的Polysome和Monosome组分中相关转录本的表达（图5C）。对于ATP5编码转录本，与shGFP对照相比，shTRAP1细胞中的这一比例要低得多；对于编码核糖体蛋白RPL36A(也称为eL42)等胞质蛋白的转录本，在shGFP和shTRAP1细胞之间，没有显示差异(图5C)。


（5）TRAP1是一种与蛋白质合成有关的伴侣蛋白
最后，作者构建并分析了TUFM共表达的线粒体翻译和代谢相关蛋白质的基因簇，主要由线粒体核糖体蛋白、电子传递链组分和组装因子以及细胞器的生物发生和代谢组成(图6A-D)。


研究结论
目前的研究结果显示：癌细胞代谢调节具有高复杂性，其中线粒体和细胞质蛋白合成都通过共同的分子伴侣TRAP1与能量代谢协同调节和协调。高等生物中蛋白质合成与线粒体呼吸之间的相关性的了解仍处于起步阶段，因此强调生物能量途径，着眼于蛋白质合成，可能为多种人类疾病的治疗开发提供一种新的方法。


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