导读：
在细胞质中， mRNA被动态地划分为翻译池和非翻译池，但这种调节的机制在很大程度上仍然是未知的。

1. body（Processing bodies）是由核糖核蛋白(RNP)颗粒动态组装而成的细胞质无膜RNA颗粒。研究表明，P-body可促进mRNA的衰变，主要参与mRNA的储存和翻译抑制，即P-body中存在大量非翻译mRNA。

本研究提出：m6A可调节mRNA在多聚核糖体（Polysome）和P-body之间的分布。通过m6A-LAIC-seq和m6A-LC-MS/MS在HeLa细胞中量化Polysome和细胞质mRNA的m6A水平，作者观察到Polysome相关的 mRNA是低m6A甲基化的，而在P-body中富集的 mRNA是高m6A甲基化的。

当m6A Writer--METTL14下调时，可将原本高m6A修饰的mRNA从P-body切换到Polysome中，以增强翻译。通过蛋白质组学分析，作者发现了一个特定的m6A Reader--IGF2BP3富集于P-body。而且IGF2BP3是将靶mRNA从Polysome切换到P-body的必要和充分条件。这些发现为mRNA在翻译和非翻译池之间以依赖于m6A的方式分配的动态调节提供了一个模型。
文章索引
标题：m6A modification negatively regulates translation by switching  mRNA from polysome to P-body via IGF2BP3.
发表期刊：Molecular Cell
发表时间：2023.11
作者及团队：武汉大学周宇教授团队
IF：16
DOI：10.1016/j.molcel.2023.10.040.

研究思路


研究结果

1. Polysome中翻译状态的mRNA呈现低m6A甲基化

为了探索m6A修饰的mRNA对翻译机器的可及性，作者表征了细胞质总 mRNA和Polysome中参与主动翻译的mRNA中的m6A水平(图1A)。
首先联合Polysome-seq和RNA-seq来分析HeLa细胞中单个mRNA的翻译速率（TR）。同时，对总RNA进行m6A-LAIC-seq (m6A亲和层析和测序)，以测量每个mRNA上的m6A水平。从这些分析中，作者得以评估了10,837个细胞质mRNA和10,865个Polysome RNA的m6A水平。

作者比较了Polysome和细胞质中所有mRNA的m6A水平，发现与细胞质 mRNA相比，Polysome部分的mRNA总体上m6A水平显著较低(图1B)。RT-qPCR进一步证实了这种差异(图1C)。此外，作者使用m6A-LC-MS/MS分别定量了Polysome和细胞质RNA的m6A水平，发现Polysome mRNA的m6A/A比值比细胞质mRNA低(图1D)。这些结果表明，主动翻译mRNA的m6A水平较低，表明m6A水平高的mRNA不能有效翻译。


作者根据mRNA的m6A水平将其分为三组(低、中、高)，发现m6A水平与细胞质mRNA的TR呈负相关(图1E)。以两个代表性基因为例，EP300 mRNA具有低TR但高m6A水平，而ADSL则具有高TR但低m6A水平(图1F和图1G)。上述结果表明m6A对mRNA翻译有负面影响。

（2）高度m6A甲基化的mRNA在P-body中富集
上述结果显示Polysome mRNA具有相对较低的m6A水平(图1D)，因此作者推测：m6A修饰的RNA可能储存在细胞质中的某些亚细胞器中，从而与翻译机器隔离。已知P-body是储存未翻译mRNA的无膜细胞器，那含有m6A的 mRNA是否在P-body中积累呢？

作者对P-body进行了GFP-LSM14A标记，荧光激活颗粒分选(FAPS)纯化后，然后进行RNA-seq，计算所有mRNA的相对PE评分(图2A-B)。结果显示：PE分数与大多数mRNA的TRs呈负相关(图2C)，P-body RNA富集分数与m6A水平呈正相关（图2D）。以两个代表性基因为例，EP300 mRNA具有高m6A水平和较大的PE，而ADSL mRNA具有低m6A水平和较小的PE(图2E-F)。

另外，与Ploysome样本相反，m6A LC-MS/MS结果显示，P-body RNA与细胞质mRNA相比具有更高的m6A/A比率(图2G)。

作者进一步使用smiFISH检测了m6A高水平mRNA和m6A低水平mRNA的亚细胞定位。结果发现m6A高水平mRNA确实都定位于P-body中(图2H)。此外，P-body富集基因的GO分析显示，其生物学途径与高m6A水平基因相似(图2I-J)。总的来说，这些结果表明P-body中翻译抑制的mRNA高度甲基化。

（3）HeLa细胞中，m6A的缺失导致 mRNA从P-body重新分布到Polysome
鉴于高m6A水平的mRNA低翻译，且在P-body中富集，作者下一步试图研究干扰m6A水平是否会影响Polysome和P-body中的mRNA分布。

作者以EIF3A基因缺失为阳性对照，采用Polysome profiling技术发现METTL14敲低后Polysome组分显著增加(图3A)。同时，对METTL14敲除和对照样本的进行了Polysome-seq和总RNA-seq。分析显示：METTL14的敲低增强了那些最初被m6A修饰的mRNA的翻译，并且m6A水平越高，这种作用越为显著(图3B-C)。

此外，RT-qPCR验证了METTL14敲低增强了高m6A基因的翻译(图3D)。Western blot发现翻译上调基因确实显示出更高的蛋白水平(图3E)。总之，这些数据表明，减少m6A修饰会导致更多的mRNA进入具有更高TR的Polysome中。

m6A是否调节P-body中mRNA的积累？为了系统地研究这种变化，作者纯化了P-body，并对METTL14敲除和对照样本的RNA进行了测序。结合m6A-LAIC-seq数据，发现METTL14缺失后，PE降低的mRNA(364个高m6A的 mRNA和336个中等m6A的 mRNA)比PE增加的mRNA(76个高m6A的 mRNA和213个中等m6A的 mRNA)的数量更多(图3F)。

m6A修饰的mRNA倾向于在METTL14敲低后从P-body中逃逸，因为PE的降低与其原始m6A水平呈负相关(图3G)。RT-qPCR进一步证实了m6A高水平 mRNA在P-body中的富集减少，而m6A低水平 mRNA则没有(图3H)。
 

1. P-body因子IGF2BP3的缺失增强了HeLa细胞的mRNA翻译

为了确定调节Polysome和P-body之间 mRNA分布的可能反式因子，作者对分选的P-body和总细胞质样品分别进行了LC-MS/MS(图2A)。已知的P-body因子（如DDX6、EDC3和DCP1A）在P-body中显著富集(图4A)。另外，m6A reader IGF2BP1/2/3也在P-body蛋白质组中富集(图4A)。免疫荧光证实三种IGF2BP蛋白都与P-body共定位(图4B)。

接下来，作者研究了IGF2BPs在调节 mRNA翻译中的潜在作用。Western blotting结果显示：IGF2BP3的敲低使EP300和KMT2A的蛋白水平升高，而IGF2BP1或IGF2BP2的敲低使蛋白水平变化不大，甚至略有下降(图4C)。嘌呤霉素掺入实验发现只有IGF2BP3的敲低会导致蛋白质合成剧烈增加(图4D)。Polysome profiling分析发现IGF2BP2和IGF2BP3的敲低都导致Polysome组分增加，并且IGF2BP3敲低的影响更大(图4E)。

考虑到IGF2BP3在P-body中富集，而P-body也含有许多翻译抑制因子，如图4A所示的4E-T。因此作者研究了IGF2BP3是否直接与这些翻译抑制因子相互作用。Co-IP验证了IGF2BP3以不依赖RNA的方式与4E-T和DDX6相关，而IGF2BP1和IGF2BP2与4E-T的相互作用较弱，不与DDX6结合(图4F-4H)，表明IGF2BP3介导的相互作用有助于将 mRNA定位到P-body中。


 

1. IGF2BP3在Polysome和P-body之间重新分配m6A修饰的mRNA

接下来，作者进行IGF2BP3敲低和对照样本的Polysome-seq和细胞质RNA-seq，确定IGF2BP3是否以m6A依赖的方式调节mRNA翻译(图4E)。

结果显示：IGF2BP3缺失后，579个m6A高水平mRNA和733个m6A中等水平mRNA与Polysome相关性增加，208个m6A高水平mRNA和714个m6A中等水平mRNA的TR降低(图5A)。

整体来看，IGF2BP3敲低后，m6A水平较高的mRNA的TR增加更多(图5A-B)。RT-qPCR证实，IGF2BP3的敲低增加了m6A高水平mRNA的翻译，但对m6A低水平mRNA的翻译影响不大(图5C)。


此外，作者分别对IGF2BP3、METTL14或YTHDF1敲降细胞的Polysome-RNA和胞质mRNA进行了m6A LC-MS/MS。IGF2BP3敲低后Polysome mRNA的m6A/A比值增加，而METTL14或YTHDF1敲低时则没有增加(图5D)。值得注意的是，IGF2BP3敲低后，胞质总mRNA中的m6A/A比值没有明显变化(图5D)。METTL14和IGF2BP3敲低样本之间翻译增加的 mRNA有相当多的重叠(图5E)。

整体来看，当IGF2BP3敲低时，m6A修饰的mRNA倾向于从P-body中逃逸，因为PE的降低与其原始m6A水平呈负相关(图5F-G)。代表性基因的RT-qPCR证实了这一模式(图5H)。

此外，对IGF2BP3敲低和对照细胞的P-body和细胞质mRNA进行了m6A LC-MS/MS，观察到IGF2BP3敲低后P-body mRNA的m6A/A比值降低(图5I)。

因此，无论是通过敲低METTL14来降低mRNA上的m6A水平，还是通过降低IGF2BP3来阻断mRNA向P-body的运输，都会导致那些原本具有高水平m6A修饰的mRNA的PE降低和TR增加，而低m6A水平的mRNA则缺乏这种变化(图5J)。综上所述，这些结果表明IGF2BP3调节了m6A修饰转录本在Polysome和P-body之间的分布。
 

1. IGF2BP3直接抑制mRNA翻译并将mRNA重新定位到P-body

为了获得IGF2BP3调控其靶mRNA翻译和定位的直接证据，作者进行了Rluc-MS2 tethering实验(图6A)。Western blot结果显示FLAG-MCP(阴性对照)和FLAG-IGF2BP3-MCP蛋白表达良好(图6B)。

将FLAG-IGF2BP3-MCP系在报告基因mRNA上导致荧光素酶表达减少约30%(图6C)，而其mRNA丰度没有显著变化(图6D)，翻译效率与对照组相比下降了约40%(图6E)。RT-qPCR进一步检测了转染MCP或IGF2BP3-MCP的细胞中Rluc-MS2 mRNA在核糖体组分的分布。在表达IGF2BP3-MCP的细胞中，Rluc-MS2 mRNA的相对分布从Heavy polysome组分向Light polysome和Monosome组分转变(图6F)，表明由于IGF2BP3结合而导致翻译减少。

为了检测报告基因 mRNA的定位，作者将20个BoxB茎环克隆到Rluc-MS2的3'UTR中，并将其与融合了mCherry的BoxB外壳蛋白λN (λN-mCherry)共转染(图6G)。结果发现，将IGF2BP3-MCP粘附到报告mRNA上可驱动 mRNA进入P-body，而MCP单独缺乏这种效果(图6H)。

综上所述，这些结果表明IGF2BP3的结合可直接将靶点重新分配到P-body上，从而抑制了mRNA的翻译。



研究结论
这项工作揭示了：

• Polysome相关mRNA是低m6A甲基化的；
• P-body相关mRNA是超m6a甲基化的；
• 全局m6A降低，将mRNA从P-body转至到Polysome；
• 在HeLa细胞中，m6A reader--IGF2BP3驱动m6A甲基化的mRNA到P-body中。

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