【细胞如何感知核糖体停滞？】| ：“报警器”ZAKα的全套机制

导读：

想象一座城市有上百万辆卡车在运转，只要有一辆抛锚，交通警报就会拉响——细胞里的“卡车”就是核糖体，而上百万个核糖体中只要有少数几个停滞，细胞就能精准感知并启动应急程序。这个“报警器”就是MAP3激酶ZAKα。但长期以来，科学界一直没搞明白：ZAKα究竟如何在几百万个正常核糖体中，精准“逮到”那几个出问题的？

2026年6月，哥本哈根大学Simon Bekker-Jensen团队在Molecular Cell发表研究，用AlphaFold3 + iCLIP + Ribo-seq的组合拳，完整画出了ZAKα在核糖体上的“巡视姿势”。

 

文章索引：

标题：Mechanism of RACK1-dependent ZAKα activation at stalled and collided ribosomes.

发表期刊：《Molecular Cell‌‌》.

发表时间：2026.06

作者团队：哥本哈根大学细胞与分子医学系基因表达中心 Simon Bekker-Jensen团队.

IF：16.0

DOI：10.1016/j.molcel.2026.04.034.

 

 

技术应用：

① Polysome profiling：

结合MNase消化，区分“单个停滞核糖体”和“碰撞核糖体”。低剂量茴香霉素出现明显的二体/多体碰撞峰，而高剂量下碰撞峰消失（核糖体被冻结）。这一技术帮助研究者明确：在不同处理条件下，ZAKα 面对的是不同状态的核糖体。

②Ribo-seq：

用于绘制核糖体在 mRNA上的精确位置。通过对比低剂量（诱导碰撞）和高剂量（全局冻结核糖体）茴香霉素处理下的 ribosome footprint 分布，研究发现：茴香霉素主要抑制了位于CDS起始部分的核糖体。低剂量与高剂量处理的 Ribo-seq图谱高度相似，说明ZAKα在"碰撞"和"单个停滞"两种条件下对核糖体的结合方式是一致的。

 

 

研究结果

（1）ZAKα如何登上核糖体？RACK1是关键"码头"

ZAKα是细胞感知核糖体"卡壳"的警报器，但它自己是怎么爬上核糖体的？

研究用AlphaFold3对所有核糖体蛋白进行扫描，结果只有一个蛋白获得了高分——RACK1，其次是RPS27（图1A）。将这个预测结果投射到核糖体三维结构上，可以看到ZAKα在核糖体上有两个结合斑块，恰好对应RACK1和RPS27的位置（图1B）。

 

没有RACK1，ZAKα就上不了车

在HAP1和HeLa细胞中敲除RACK1后，茴香霉素（anisomycin）再也无法激活ZAKα下游的p38信号；重新表达RACK1则完全恢复（图1D）。

ZAKα用两个"抓手"抱住RACK1

AF3预测ZAKα通过C端的两个短线性相互作用基序（SLIMs，长度仅5-6个氨基酸）与RACK1结合（图1E-I）。删除其中任意一个SLIM，ZAKα就无法被茴香霉素激活（图1J）。

 

体外实验确认直接结合

ITC实验显示，ZAKα的一个SLIM肽段与纯化的RACK1蛋白直接结合，亲和力约11μM；突变肽段则完全不结合（图2A-B）。进一步，删除ZAKα的第二个RACK1结合SLIM（Δ611-617）彻底破坏了它与核糖体的共纯化（图2C），而破坏RACK1上的对接位点（dAH突变）也让RACK1失去了救援能力（图2E）。

 

（2）iCLIP锁定ZAKα在核糖体上的第二个“锚点”——18S rRNA

上一部分已经知道ZAKα通过RACK1登上核糖体，但它是否还与rRNA直接接触？iCLIP技术给出了答案。

18S rRNA helix-26是ZAKα的第二个接触点

iCLIP数据显示，ZAKα在18S rRNA 的U1114和U1120位点（对应 helix-26）有非常强的交联信号（图3A），而这个位置正好紧邻AF3预测的RPS27结合位点。

RPS27和helix-26是“联合锚点”

通过一系列突变体实验，研究逐步缩小了范围：

RACK1结合突变体仍然能正常交联到helix-26（图3B），说明这条路径独立于RACK1。删除RPS27结合SLIM及其下游正电荷区域（Δ768-780），或者删掉S结构域下游全部序列（1-713），都彻底消除了对18S rRNA的交联（图3E）。这表明ZAKα的C端通过RPS27蛋白 + 18S helix-26 rRNA形成一个复合结合位点。

将AF3预测的蛋白结合概率和iCLIP的交联计数同时映射到核糖体结构上，一幅清晰的画面浮现出来：ZAKα同时接触mRNA出口通道两侧的两个位点——一侧是RACK1，另一侧是RPS27/helix-26（图3F）。这种“跨坐”姿势让 ZAKα能够实时监控从出口通道伸出的mRNA。

 

出人意料的是，破坏RPS27-helix-26结合位点（Δ625-712 或 1-713）后，ZAKα在茴香霉素处理1小时后仍然能被正常激活，仅在15分钟时表现出轻度减弱（图3G）。这说明在茴香霉素这种强刺激下，RACK1结合和S/CTD结构域才是激活所必需的，而RPS27-helix-26位点更像是“辅助增强器”。

 

（3）ZAKα的S和CTD结构域：抓住mRNA才能站稳脚跟

iCLIP还有一个重要发现：ZAKα还与mRNA本身有大量交联。但核糖体结合缺陷的ZAKα R/K→A ΔCTD突变体几乎完全失去了mRNA交联信号（图4A）。反过来，单独破坏S结构域或CTD结构域中的一个，在未处理细胞中虽然无法结合核糖体，但茴香霉素处理后却能恢复结合并激活RSR信号——只有同时破坏S和CTD才会彻底失效（图4C）。这说明S和CTD在mRNA结合上是功能冗余的，两者都可以独立完成“抓住mRNA”的任务。

野生型ZAKα的mRNA结合图谱显示，大部分结合集中在CDS中部和5′UTR，而非3′UTR（图4B）。茴香霉素处理后，结合偏好转向5′UTR和CDS起始部分。Ribo-seq数据显示，茴香霉素主要抑制了位于CDS起始位置的核糖体（图4D-E）。两组数据高度吻合——ZAKα是跟着核糖体走的，核糖体停在哪里，ZAKα就跟到哪里。

仔细观察终止密码子周围的mRNA交联位点，发现在终止密码子上游约12 nt处有一个交联信号的“缺口”（图4F右）。这个缺口的长度正好对应一个核糖体保护的mRNA片段（约28-30 nt）。这意味着当一个核糖体停在终止密码子上时，它保护的那段mRNA就挡住了ZAKα的交联。起始密码子附近也有类似现象：茴香霉素处理后，5′UTR末端的交联信号增加，对应核糖体被阻滞在起始密码子附近（图4F左）。

 

（4）单个核糖体停滞就足够？要看在哪个细胞里说这话

ZAKα到底需要看到“核糖体撞车”才报警，还是单个核糖体“抛锚”就够了？

 

研究巧妙利用了茴香霉素的特性：低浓度（0.19μM）主要诱导核糖体碰撞，高浓度（76μM）则冻结几乎所有核糖体使其成为单个停滞状态。Polysome profiling确认了这一点——低浓度下出现明显的碰撞峰，高浓度下碰撞峰完全消失（图5A）。

在U2OS细胞中，即使在高浓度茴香霉素（无碰撞）条件下，ZAKα仍然能被激活，下游p38/JNK信号清晰可见（图5B）。时间延长至1小时后，不同浓度间的激活水平趋于一致（图5C）。更有说服力的是，LTM和HAR——这两种药物只抑制起始阶段的单个80S核糖体，根本不会产生碰撞——同样能激活 RSR（图5D-E）。因此，在U2OS细胞中，单个停滞核糖体就足以触发警报。

同样的实验换到HAP1和HEK293T细胞，结果完全不同：

高浓度茴香霉素在HAP1中只能引起很弱的ZAKα激活，在HEK293T中几乎看不到（图5F-G）。敲除GCN1后，HAP1细胞中原本不存在的HAR诱导ZAKα激活突然出现了（图5H）。但奇怪的是，这种激活与GCN2无关，也不伴随核糖体碰撞（图5I-J）。GCN1似乎是某些细胞系中专用来压制“单个停滞核糖体激活 ZAKα”的蛋白，但具体机制尚不清楚。

 

（5）ZAKα如何区分“正常通行”和“堵车”？关键在mRNA动不动

前文已知，ZAKα通过RACK1和RPS27/helix-26两个锚点跨坐在mRNA出口通道两侧，S和CTD结构域抓住mRNA。但ZAKα怎么知道核糖体是正在正常延伸还是已经卡住了？

 

用LTM处理细胞（只抑制起始，制造单个停滞核糖体），iCLIP显示ZAKα的mRNA交联信号集中在起始密码子上游约10 nt处，刚好对应一个核糖体保护片段的长度（图6A）。单个基因轨迹清晰可见：ZAKα只交联到起始密码子紧上游的区域（图6B）。HAR（另一种起始抑制剂）也得到类似结果，且5′UTR 交联更明显。这说明ZAKα确实能感知单个停滞核糖体，并稳定地结合在其 mRNA出口处。

用CC-885处理细胞（导致终止密码子处核糖体堆积碰撞），iCLIP图谱中出现两个峰：一个在终止密码子上游12 nt处，另一个在−44 nt处，间隔正好是一个核糖体保护片段长度（图6C）。第一个峰对应ZAKα结合到停滞核糖体出口的mRNA，第二个峰对应ZAKα结合到碰撞核糖体（追尾的那个）出口的mRNA。

 

综上，研究提出了ZAKα感知的统一模型（图6D-F）：

l 正常延伸：核糖体沿mRNA移动，ZAKα的S/CTD抓住的mRNA不断被“抽走”，复合结合不稳定，ZAKα很快脱落；

l 核糖体停滞：mRNA不动了，ZAKα的S/CTD与mRNA的结合稳定下来，驻留时间延长；

l 核糖体碰撞：两个停滞核糖体堆在一起，两个ZAKα分子各自以相同方式结合在各自的核糖体上，它们的结构域被拉近距离，更容易发生二聚化和激活。

 

（6）ZAKα的“安全栓”怎么解开？

最后一个问题还没解决：ZAKα从“结合”到“激活”之间，到底发生了什么分子层面的变化？

 

分子动力学模拟提出了完整激活模型：

l 静息状态：ZAKα是单体，SAM结构域游离在溶液中，随机干扰LZ，阻止二聚化；

l 核糖体结合：ZAKα通过两个SLIM抱住RACK1，其中417-422 SLIM把SAM 拖到RACK1表面“隔离”起来；

l SAM脱离LZ：LZ不再受SAM干扰，得以自由介导二聚化；

l 二聚化与激活：两个ZAKα分子通过LZ面对面排列，激酶结构域激活环发生反式自磷酸化，p38/JNK 通路启动。

 

简单来说，ZAKα的SAM结构域是内置的“安全栓”，通过干扰LZ阻止非计划激活；结合RACK1后SAM被隔离，安全栓松开，LZ介导二聚化，激酶激活——这是一套精密的“核糖体模板化”激活机制。

研究结论

ZAKα通过RACK1登上核糖体，跨坐在mRNA出口通道上"巡视"翻译过程；一旦核糖体停滞导致mRNA静止，ZAKα驻留时间延长，RACK1隔离其SAM自抑制结构域，LZ介导二聚化与反式自磷酸化，最终激活RSR——这是细胞感知"蛋白质工厂停工"的核心警报机制，对单个停滞核糖体和碰撞核糖体同样有效。

 

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