【circRNA翻译】 | 环状RNA编码新型蛋白，成前列腺癌治疗新靶点！

导读：

前列腺癌是全球男性中发病率第二的癌症，每年新发病例预计将从2020年的140万增至2040年的290万。尽管现有疗法如雄激素剥夺疗法（ADT）和新一代抗雄药物（如阿比特龙、恩杂坦米）已取得一定进展，但对晚期患者尤其是转移性前列腺癌的治疗效果仍十分有限。肿瘤异质性也限制了PARP抑制剂和免疫疗法等新策略的应用。

 

近年来，环状RNA（circRNA）作为一类共价闭合的非编码RNA，在肿瘤发生发展中的作用日益受到关注。新研究发现，circSPIRE1可通过“滚动圈翻译”机制编码一种新型蛋白rtSPIRE1，并通过稳定LRP5蛋白激活PI3K/AKT信号通路，从而促进前列腺癌的增殖和转移。该研究不仅揭示了circRNA编码功能在癌症中的重要作用，还为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。

 

文章索引：

标题：A novel polypeptide encoded by circSPIRE1 promotes prostate cancer proliferation and migration by restraining the ubiquitin-dependent degradation of LRP5.

发表期刊：《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》.

发表时间：2025.07

作者团队：中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科 许可慰教授团队

IF：12.8

DOI：10.1186/s13046-025-03467-8.

 

翻译组学技术在该研究中的运用​​

本研究充分利用了翻译组学技术，尤其是多核糖体分析（polysome profiling），来解析circSPIRE1的翻译活性。通过蔗糖梯度离心分离不同翻译状态的核糖体复合物，并结合RT-qPCR和Western blot，研究团队证实了circSPIRE1与多核糖体的结合，表明其具有活跃的翻译功能。

 

研究结果

（1）circSPIRE1在前列腺癌中的识别和表征

为了探索环状RNA（circRNAs）在前列腺癌进展中的潜在作用，作者对三名前列腺癌患者的癌组织和癌旁正常组织进行了高通量circRNA微阵列分析（图1A）。发现前列腺癌组织中45个circRNA显著上调、192个下调（图1B），并从中筛选出七个具有翻译潜能的circRNA，其中circSPIRE1表达最显著（图1C）。

RT-qPCR验证显示circSPIRE1在癌组织和细胞系（尤其PC3和DU145）中高表达（图1D-F）。分子特征分析证实circSPIRE1通过反向剪接形成（图1G），仅存在于cDNA中（图1H），主要定位于细胞质（图1I-K），且为非多聚腺苷酸化结构（图1L）。稳定性实验表明circSPIRE1比线性RNA更稳定（图1M-N），提示其作为稳定环状RNA在细胞质中可能发挥功能。

 

 

 

 

（2）circSPIRE1与临床特征相关并促进前列腺癌进展

随后，作者进一步探讨circSPIRE1在前列腺癌中的表达模式及临床意义。通过FISH成像分析（图2A），发现circSPIRE1在前列腺癌组织中表达显著上调（红色信号），与癌旁正常组织相比差异明显，细胞核由DAPI染色（蓝色）。对80例患者的定量分析显示，57.50%的病例中circSPIRE1表达上调，17.50%下调，25.00%无变化（图2B）。进一步相关性分析表明，circSPIRE1高表达与更高Gleason评分（>7）、晚期肿瘤分期（T3-T4）、转移状态（M1）和临床分期（III-IV）显著正相关（图2C-E），提示其作为前列腺癌进展的潜在生物标志物。

 

 

 

 

功能上，通过RT-qPCR验证了circSPIRE1敲低和过表达模型的有效性（图F），CCK8实验显示circSPIRE1过表达显著增强PC3和DU145细胞的活力和增殖（图2G-H），而克隆形成实验和EdU检测进一步证实其促进细胞增殖能力（图2I-J）。Transwell和伤口愈合实验表明，circSPIRE1过表达加剧细胞迁移和侵袭（图2K-M）。这些结果综合表明，circSPIRE1通过调控细胞增殖、迁移和侵袭，促进前列腺癌进展，且其表达水平与临床恶性特征紧密相关。

 

（3）circSPIRE1通过IRES介导的滚动环翻译驱动生物功能

为了研究 circSPIRE1是否主要通过蛋白质翻译发挥作用而不是充当miRNA 海绵，作者进行了 RNA 免疫沉淀 (RIP) 试验（图3A）。发现circSPIRE1与AGO2结合较弱，表明其不太可能通过miRNA海绵机制发挥作用。Polysome profiling分析（图3B）显示，过表达circSPIRE1后，整体翻译活性提升。结合qPCR实验（图3C）进一步证实circSPIRE1主要与多核糖体结合（以hY1为阴性对照）。TransCirc数据库分析（图3D）识别出circSPIRE1包含一个由ATG起始但无终止密码子的开放阅读框（ORF），支持滚动圈翻译潜力。

 

 

为验证翻译功能，设计了Flag标签构建体（图3E）：circSPIRE1-Flag（完整ORF）和circSPIRE1-Flag-mut（引入终止密码子突变）。Western blot（图3F）在circSPIRE1-Flag组中检测到三个主要蛋白条带（约17 kDa），与ORF循环翻译产物一致；SDS-PAGE和质谱分析（图3G）确认这些条带为circSPIRE1编码的多肽，命名为rtSPIRE1。线性重复ORF构建体（1R-4R）的Western blot（图3H-I）显示，主要翻译产物对应1-3个ORF重复，支持滚动圈翻译终止于程序性核糖体移码。

 

 

双荧光素酶报告系统（图3J-K）证明全长circSPIRE1 IRES具有强活性（Luc/Rluc比值最高），显著高于缺失突变体，证实IRES驱动翻译。RNA pulldown（图3L）和Western blot验证（图3M-N）发现hnRNPA1特异性结合circSPIRE1；RIP实验（图3O-P）进一步显示hnRNPA1与野生型circSPIRE1结合增强，而与IRES缺失突变体结合减少，表明hnRNPA1通过IRES区域调控翻译。

 

这些结果综合揭示circSPIRE1通过IRES介导的滚动圈翻译生成rtSPIRE1蛋白，且该过程受hnRNPA1调控，为其生物学功能提供机制基础。

 

（4）hnRNPA1 SDMA修饰促进circSPIRE1 IRES活性

---hnRNPA1与circSPIRE1的相互作用与功能验证

FISH结合免疫荧光技术（图4A）发现hnRNPA1与circSPIRE1在细胞质中显著共定位，提示两者可能存在直接相互作用。Western blot分析（图4B）显示，hnRNPA1敲低呈剂量依赖性降低circSPIRE1的翻译产物水平，表明hnRNPA1是circSPIRE1翻译的正调控因子。双荧光素酶报告实验（图4C）进一步证实，hnRNPA1敲低导致Fluc活性（代表IRES驱动翻译）剂量依赖性下降，而Rluc活性（内部控制）无变化，说明hnRNPA1特异性促进circSPIRE1 IRES活性。短期hnRNPA1敲低（150 nM）不影响细胞活力或circSPIRE1 RNA水平（图4D），排除非特异性效应。

 

---hnRNPA1过表达与结合位点鉴定​​

过表达实验显示，外源hnRNPA1-HA表达剂量依赖性增加（图4E），并伴随Fluc活性升高（图4F），而Rluc活性不变，再次验证hnRNPA1对IRES的特异性增强作用。Rluc敲低实验（50 nM）验证了双荧光素酶报告系统（100 ng）的可靠性（图4G-H），确保IRES活性测量的准确性。分子对接分析（图I-J）识别出circSPIRE1 IRES区域的G-135位点为hnRNPA1的关键结合位点。RIP实验（图4K）显示，hnRNPA1与野生型circSPIRE1结合强烈，但与G135U突变体结合显著减少，证实该位点对相互作用至关重要。

 

 

 

---SDMA修饰的核心调控作用​​

共转染实验（图4L-M）表明，hnRNPA1与circSPIRE1 IRES的相互作用呈剂量依赖性，影响Fluc活性。使用SDMA抑制剂EPZ015666（10 μM）处理（图4N），可显著降低Fluc活性而不影响Rluc，表明SDMA修饰是IRES活性必需的。IP实验（图4O）发现，hnRNPA1的R218K/R225K双突变体SDMA修饰水平大幅降低，提示这些精氨酸残基是SDMA修饰的关键位点。后续RIP实验（图4P-R）显示，EPZ015666处理或SDMA缺陷突变体（R218K/R225K）均导致hnRNPA1与Fluc及circSPIRE1的结合显著减少（图4S-U），证明SDMA修饰直接调控hnRNPA1与IRES的结合亲和力。

 

综上，hnRNPA1通过其SDMA修饰（尤其R218和R225位点）增强与circSPIRE1 IRES区域（G-135位点）的结合，从而促进IRES介导的翻译起始。这一修饰依赖性机制揭示了hnRNPA1作为转录后调控因子在circRNA翻译中的关键作用，为靶向SDMA通路干预前列腺癌进展提供了理论依据。

 

（5）新型蛋白rtSPIRE1在前列腺癌中的临床意义

为了验证针对独特rtSPIRE1肽序列（RKVMLCAAHLPTES）的定制兔多克隆抗体的特异性和有效性，作者进行了免疫荧光和蛋白质印迹分析。

 

免疫荧光分析（图5A）发现rtSPIRE1主要定位于细胞质，且定制抗体与Flag抗体染色模式一致，验证了其识别特异性。Western blot实验（图5B-C）证实该抗体能有效检测过表达和内源性rtSPIRE1，显示高灵敏度和特异性。对8对前列腺癌组织的分析（图5D）显示，rtSPIRE1在多数癌组织中表达上调。大样本免疫组化染色（100例患者，图5E）进一步证实rtSPIRE1在前列腺癌组织中显著高表达（图5F）。临床关联分析表明，rtSPIRE1表达与肿瘤分期正相关（图5G），且随Gleason评分升高表达逐渐增加（图5H-I）。生存分析显示，rtSPIRE1高表达患者无复发生存期和总生存期显著缩短（图5J），提示其作为独立预后标志物的潜力。这些结果综合表明，rtSPIRE1在前列腺癌中特异性高表达，与肿瘤恶性进展和不良预后紧密相关。

 

 

（6）新型蛋白rtSPIRE1促进前列腺癌的增殖和转移

为了进一步探究rtSPIRE1的生物学功能，作者进行了一系列功能实验，包括CCK8（图6A）、克隆形成（图6B）、EdU掺入（图6C-D）、伤口愈合（图6E-F）以及Transwell迁移和侵袭实验（图6G-H）。与空载体组和circSPIRE1-flag-mut组相比，circSPIRE1-flag组的增殖、侵袭和迁移能力显著增强。这些结果表明rtSPIRE1在促进肿瘤进展中起着关键作用。

 

 

 

体内实验中，皮下异种移植模型（图6I-K）证实rtSPIRE1编码组肿瘤体积和重量显著增加（n=6），表明其增强体内增殖能力；尾动脉注射骨转移模型（图6L）通过生物发光成像、X射线和H&E染色显示，rtSPIRE1组骨转移灶形成增加，统计分析（图6M）揭示骨转移率显著升高（n=8）。生存分析（图6N）表明rtSPIRE1组小鼠总生存期缩短。这些结果综合证明，rtSPIRE1通过促进细胞增殖、迁移、侵袭和体内转移，驱动前列腺癌进展和恶化。

 

（7）circSPIRE1激活PI3K/AKT信号通路，通过抑制LRP5的泛素化来稳定LRP5

接着，作者系统揭示了circSPIRE1通过稳定LRP5蛋白并激活PI3K/AKT信号通路促进前列腺癌进展的分子机制。

 

 

 

circSPIRE1通过抑制LRP5的泛素化降解，稳定LRP5蛋白，从而持续激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，并诱导EMT，最终驱动前列腺癌增殖和转移。这一发现揭示了circRNA-蛋白相互作用在肿瘤信号传导中的新机制，为靶向LRP5-PI3K/AKT轴的治疗策略提供了理论基础。

 

（8）LRP5对于rtSPIRE1介导的增殖、迁移和PI3K/AKT激活至关重要

最后，作者采用系列功能验证实验证实了LRP5在rtSPIRE1介导的增殖、迁移中的作用（图8A-E）。Western blot分析提供了关键的分子机制，揭示出LRP5调控PI3K/AKT通路（图8F）。

 

 

机制示意图（图8G）完整概括了本研究的核心发现：hnRNPA1通过其SDMA修饰促进circSPIRE1的IRES介导的滚动圈翻译，产生功能肽rtSPIRE1；rtSPIRE1通过与LRP5结合，抑制其泛素化降解，稳定LRP5蛋白水平；稳定的LRP5进而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，驱动前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，最终促进肿瘤进展。

 

这些结果明确了LRP5是rtSPIRE1下游信号传导的关键效应器，为开发针对该通路的前列腺癌治疗策略提供了新的靶点。

 

研究结论

这项研究表明，hnRNPA1调控IRES驱动的circSPIRE1滚动环翻译，产生功能肽rtSPIRE1。通过稳定LRP5，rtSPIRE1激活PI3K/AKT信号通路，从而促进前列腺癌的进展。这些发现突出了靶向环状RNA编码肽治疗前列腺癌的治疗潜力。

 

circSPIRE1/rtSPIRE1——前列腺癌的新调控轴

 

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