Mol Cancer. | 黑色素瘤的m6A表观遗传调控中Polysome profiling的技术应用

导读
m6A甲基转移酶和去甲基化酶调控的RNA动态m6A修饰，可影响基因表达、选择性剪接和细胞命运。眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤(UM)和结膜黑色素瘤(CM)，是成人最常见的原发性眼部肿瘤。然而，m6A修饰在眼黑色素瘤中的功能作用尚不清楚。

本研究揭示出RNA甲基化可显著抑制UM和CM的进展。眼部黑色素瘤样本显示m6A水平降低，提示预后不良。在体外和体内，总体m6A修饰的变化与肿瘤进展高度相关。在机制上，HINT2作为一种眼部黑色素瘤中的肿瘤抑制因子，YTHDF1促进了甲基化的HINT2 mRNA的翻译。因此，本研究阐释了m6A甲基化在眼部黑色素瘤中的关键功能，并为理解m6A修饰提供了新的见解。

文章索引
标题：m6A modification suppresses ocular melanoma through modulating HINT2 mRNA translation
发表期刊：Molecular Cancer
发表时间：2019.11
作者团队：上海交通大学附属九院眼科范先群教授课题组与北京中科院基因所杨运桂教授课题组
IF：37.3
DOI：10.1186/s12943-019-1088-x.

研究概览


研究结果

1. 眼部黑色素瘤中m6A修饰水平降低

为了研究m6A甲基化在恶性眼黑色素瘤中的功能作用，作者首先检测了眼黑色素瘤中相对于正常样本的整体m6A水平。在肿瘤样本中观察到mRNA中m6A修饰显著减少(图1a)。另外，与正常组织相比，m6A“writer”METTL3在眼黑色素瘤组织中的表达也有所降低(图1b)，而m6A“eraser”ALKBH5的表达趋势则相反(图1c)。因此，眼黑色素瘤细胞中m6A水平的下降(图1a)可能是由于METTL3下调和ALKBH5上调。

此外，较低的METTL3表达预示着较早的复发和增强的侵袭性(图1d-e)。同样，ALKBH5表达升高提示预后不良(图1f)，表明整体m6A水平降低预示着更高的恶性肿瘤。

这些数据表明，大部分眼部黑色素瘤的特征是METTL3表达降低或ALKBH5表达增加，最终导致m6A修饰水平降低。
 

2. m6A甲基化抑制眼部黑色素瘤

为了评估整体m6A水平是否与眼部黑色素瘤的肿瘤发生有关，作者在正常色素细胞和眼部黑色素瘤细胞中抑制METTL3的表达。沉默METTL3后，正常黑素细胞PIG1克隆形成增多(图2a, b)。GSEA分析发现较低的整体m6A甲基化促进了肿瘤发生，并确定了主要由METTL3调控(图2c)。

同时，作者还抑制去甲基化酶ALKBH5的表达。当ALKBH5被敲除时，在m6A甲基化较高的黑色素瘤细胞中，集落形成率降至20%(图2d-e)，这些细胞的迁移能力明显较弱(图2f-g)。眼部黑色素瘤细胞的转录组测序和GSEA分析进一步证实了m6A修饰水平较高的抗肿瘤作用，并鉴定出ALKBH5的主要靶基因簇(图2h)。
 

3. MeRIP-seq和RNA-seq确定潜在的m6a介导的靶标

为了了解m6A修饰在基因表达中的调节作用，作者对正常细胞和眼部黑色素瘤细胞进行了MeRIP-seq和miCLIP-seq分析。

首先，得到了典型的RACH基序特征的m6A峰(图3a)，并且在3 ' UTR中富集(图3b-c）。

与正常对照细胞相比，肿瘤细胞中的m6A修饰整体上减少，并且在检测到的m6A峰中，正常细胞中只有一个m6A位点的基因更多(图3d)。作者总共鉴定出5828个基因具有显著的m6A修饰。在这些基因显著富集在细胞增殖和细胞死亡方面(图3e)与HIF-1和p53信号通路(图3f)，提示m6A修饰在肿瘤发生过程中具有调控作用。

另外，正常细胞中m6A修饰程度更高的转录本数量是肿瘤细胞的5倍以上(图4a)。这些转录本参与了与细胞增殖和肿瘤发生相关的几种信号通路(图4b)。

为了系统地阐明眼部黑色素瘤中m6A修饰减少导致的基因表达变化，作者比较了正常细胞和肿瘤细胞的转录组差异。结果显示：许多m6A修饰的基因在mRNA表达和蛋白表达之间不一致(4c)，表明m6A修饰的翻译可能存在转录后调节。这些基因始终参与细胞周期、细胞粘附和蛋白质过程(图4d)。

HINT2是正常细胞中蛋白表达和m6A富集最显著的基因之一，因此将其作为典型分子来分析m6A修饰在肿瘤发生中的作用机制(图4e)。miCLIP-seq数据中，HINT2 mRNA 3'UTR上的中有一个m6A峰，在正常细胞中尤其富集(图4f)。
 

4. HINT2以依赖m6A的方式抑制眼黑色素瘤

有报道称HINT2在肝细胞癌和胰腺癌中具有抑瘤作用，那在眼黑色素瘤中的作用是什么呢？

GSEA显示，HINT2促进肿瘤细胞凋亡和细胞死亡(图5a)。作者通过过表达HINT2来测试HINT2的肿瘤抑制作用。与对照组相比，hint2过表达组(图5b)的肿瘤体积缩小(p < 0.01)(图5b)。

同时，在眼部黑色素瘤和正常组织中进行了IF染色，发现HINT2确实在肿瘤样本中下调(图5c-d)。值得注意的是，在眼黑色素瘤组织样本中，较低的HINT2表达与预后不良高度相关(图5e-f)。

由于在眼黑色素瘤中，HINT2抑制细胞生长和迁移，并且与正常细胞相比，肿瘤中m6A甲基化降低，因此假设m6A修饰减少可能通过上调HINT2表达来部分抑制肿瘤生长。

研究HINT2 mRNA的m6修饰状态时，发现3'UTR上的m6A峰被METTL3特异性甲基化，被ALKBH5特异性去甲基化(图6a-b)。当METTL3被敲低时，HINT2表达量下降，而当ALKBH5被敲低时，其表达量则上调（图6c-d），表明HINT2的翻译受到其m6A修饰的正向调节。

那在眼部黑色素瘤中，增强m6A修饰后观察到的增殖减少是否与HINT2表达降低有关呢？作者观察了在m6A上调的细胞中抑制HINT2表达后的表型(图6e，lane3-4)。在ALKBH5敲低细胞中抑制HINT2可促进细胞增殖(图6f-h)。
 

5. m6A的修饰促进了HINT2的翻译

m6A甲基化可能促进了HINT2的翻译，作者推测HINT2转录本是YTH家族的靶标。RIP-qPCR分析显示，与其他mRNA相比，HINT2 mRNA与YTHDF1的相互作用更强(图7a)。RNA pull-down实验进一步证实了YTHDF1与HINT2 mRNA的相互作用，并且HINT2的m6A修饰极大地促进了其与YTHDF1的结合(7b-c)。

YTHDF1基因敲低，HINT2蛋白表达降低。而YTHDF1过表达则增加了HINT2蛋白表达(7d-f)。


这些HINT2表达的变化不是由于其转录物丰度的变化(图7d-f )。双荧光素酶测定显示，ALKBH5显著降低了野生型HINT2 3’UTR片段的报告基因的荧光素酶活性(图7g)。


Polysome profiling分析显示：ALKBH5敲除后，HINT2 mRNA主要分布在多聚核糖体组分中，表明HINT2转录物与多聚核糖体的关联可通过其m6A修饰得到改善（图7h）。

综上所述，这些实验表明YTHDF1识别m6A修饰，而对HINT2的翻译有影响。


研究结论
本研究发现m6A 甲基化调节肿瘤抑制基因HINT2的翻译，从而调节眼部黑色素瘤的发生。阐释了m6A甲基化在眼部黑色素瘤中的关键功能，并为理解m6A修饰提供了新的见解。


欢迎致电了解详情或咨询!
广州卿泽生物科技有限公司
地址：广州市黄埔区伴河路96号一栋三层321房
电话:18925086102(微信同号)