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广州卿泽生物科技有限公司
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多聚核糖体分析技术Polysome profiling-Seq检测
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公司新闻/正文
Ribosome & polysome profiling送样要求
851 人阅读发布时间：2024-01-09 14:33
1 样本准备前注意事项
1.1生物学重复
取样过程中，为了减少人为造成的样品间差异，可以采取如下措施：取样时间、部位、处理条件、操作过程等方面尽可能保持一致，否则会影响实验结果的可重复性和可信度。
1.2样品的保存
取样后，在简单处理并标记后，-80℃冰箱保存，以避免实验操作前样品降解的可能性。
2 送样要求
2.1 贴壁细胞收样（>1X107）
（1）从培养箱中取出贴壁细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好。于48h前或者需要的处理时间前，铺皿。
（2）待细胞密度达70%左右，加入(CHX, 终浓度为100μg /mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。
（3）胰酶（0.25%）消化后，收细胞同常规操作。最后加入预冷的PBS (0.01M，含100μg /mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。
2.2 悬浮细胞收样（>1X107）
（1）从培养箱中取出悬浮细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好。于48h前或者需要的处理时间前，铺皿。
（2）待细胞密度达70%左右，加入(CHX, 终浓度为100μg /mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。
（3）离心收集细胞后，加入预冷的PBS (0.01M，含100μg /mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。
注意事项：
外周血中，外周血单个核细胞（PBMC）在机体免疫中发挥了极其重要的作用。将血液中多核细胞和红细胞去除后，可分离出PBMC，从而能够方便地模拟体外的血液免疫环境。PBMC的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，其比重为1.070左右，而红细胞和多核白细胞的比重超过1.080。通过利用介于两者比重之间的溶液(分层液或密度梯度分离液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与PBMC分离。具体操作如下：
1. 使用EDTA抗凝管（BD，0202992058）采集6 mL外周血。
2. 将新鲜血液转移到15 mL离心管中，室温2000rpm离心10min。
3. 用1mL移液器小心将上层血清吸出。
4. 将上述已去血清后的血液用生理盐水按照1:1（体积比）进行稀释，轻轻吹打3-5次混匀。
5. 将Ficoll试剂充分震荡，上下颠倒5-10次混匀，分装到15ml离心管中（Ficoll溶液与稀释后的血液体积比为3:4），竖直放置到水平台面上静止备用。
6. 将稀释好的血液用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含Ficoll溶液的离心管中。（Ficoll溶液与稀释后的血液体积比为3:4）
7. 将离心管小心缓慢转移至离心机中，尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层。室温400×g，升降速为1，离心30分钟。
8. 离心结束后分4层，由下到上分别为红细胞、Ficoll溶液、淋巴细胞层、生理盐水。
9. 用移液枪吸取一部分生理盐水，将枪头插进淋巴细胞层中小心吸取，转移至新的15 mL离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞造成污染。
10. 加入10mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，室温100×g，离心10min 。
11. 弃上清，加入1mL红细胞裂解液，裂解3min。室温300×g，离心5min。
12. 弃上清，加入10mL生理盐水轻轻吹打混匀，室温100×g，8min离心。重复2次。
13. 弃上清，用1640完全培养基重悬细胞，加入(CHX, 终浓度为100μg /mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。
14. 同时取样进行台盼蓝染色，看细胞活率、细胞浓度。
15. 离心收集细胞后，加入预冷的PBS (0.01M，含100μg /mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。
2.4 组织样品 (>100mg)
2.4.1动物组织
2.4.1.1斑马鱼胚胎
2.4.1.2哺乳动物组织
注意：翻译是高度动态变化的，对内部和外部信号都有快速的反应。为了准确测量整个组织的体内翻译情况，必须尽快切除并快速冷冻相关组织，最大限度地减少了核糖体从转录本上脱落而引起的翻译变化。
（1）准备必要的手术工具，确保操作环境无RNase，备好液氮。
（2）按照实验室的标准程序，迅速处死动物并摘取目的组织。
（3）用高压灭菌后的无RNase PBS清洗组织，去除多余的结缔组织血液。
（4）在液氮中快速冷冻组织，冷冻后碾磨成粉末转移冻存管。
（5）-80度保存，干冰运输。
2.4.2植物组织（100mg）
（1）准确取得所需组织后，立即用准备好的铝箔包裹组织。
（2）立即投入液氮冷冻,冷冻后碾磨成粉末转移冻存管，-80度保存，干冰运输。
（3）填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
包裹组织的铝箔或冷冻保存管转入样本袋时，请按以下步骤进行：把样本袋（纱布袋）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷冻的组织放入样本袋（每个样本袋只保存同样的组织，样本较多时应分装至多个小袋，不要在一只样本袋中放过多的样本以防无法放入液氮罐或无法送液氮罐取出），袋口留一根编号绳，绳上粘两张标签纸（标签上注明：客户名、样本名称、编号、日期，粘2 张标签纸是为了防止标签脱落造成样本混乱），迅速转入液氮罐。
2． 如使用广口容器液氮暂存
建议用进口高质量冻存管，油性笔标记后，样品迅速放入管中，拧紧后迅速放入液氮中。然后再转移到超低温冰箱中保存。
3． 直接干冰中保存并快递的
建议全部用进口冻存管，油性笔标记后，样品迅速放入经干冰预冷的冻存管中，放入样品袋，埋入干冰中，密封包装后，运输。
不要用国产冻存管，因为国产冻存管从液氮中取出时也常发生爆裂，可能造成样品损失或伤人。
4. 处于不同发育阶段以及不同生长条件的样本中所含有的RNA 的量是不同的，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中RNA 的量可能与常规相应样本有显著的差异。存储条件以及存储时间也是影响RNA 得率的关键因素，一般来说从新鲜的样本中总是能够的到预期的RNA 产量，但是没有保存在液氮或者-80℃冰箱中的样品是不可靠的。即使是保存在液氮或者-80℃冰箱中的样品，如果存储时间过长，RNA 产量也会显著降低。因此，实验中组织的需要量只能以实际抽提结果为准。
强烈建议：
为确保实验顺利，我们强烈建议您在取样时，应同时备份2-3 份，如备份3 份，则送给我们两份，如备份2 份，则送样一份，您自己留一份，以防备部分样品降解，重新取材或送样将耽误您的时间。即使样品全部合格，备份的样品您还可以用来进行其他方面的实验（如定量验证、蛋白方面，生化方面的实验等）。
备份又分为两种，一种为严格备份，即：样品取下后一分为二，这样的两份样品基本上具备同性质。另一种为非严格备份，即生物学重复的样品，这样的备份样品同质性要较前者差。
参考文献：
This protocol is an updated version of the protocol posted by Huili Guo (8/8/10), which detailed the approach she used for ribosome profiling and mRNA-seq in Guo et al., Nature 466: 835–840 (2010); available at http://bartellab.wi.mit.edu/protocols.html.
1.1生物学重复
取样过程中，为了减少人为造成的样品间差异，可以采取如下措施：取样时间、部位、处理条件、操作过程等方面尽可能保持一致，否则会影响实验结果的可重复性和可信度。
1.2样品的保存
取样后，在简单处理并标记后，-80℃冰箱保存，以避免实验操作前样品降解的可能性。
2 送样要求
2.1 贴壁细胞收样（>1X107）
（1）从培养箱中取出贴壁细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好。于48h前或者需要的处理时间前，铺皿。
（2）待细胞密度达70%左右，加入(CHX, 终浓度为100μg /mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。
（3）胰酶（0.25%）消化后，收细胞同常规操作。最后加入预冷的PBS (0.01M，含100μg /mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。
2.2 悬浮细胞收样（>1X107）
（1）从培养箱中取出悬浮细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好。于48h前或者需要的处理时间前，铺皿。
（2）待细胞密度达70%左右，加入(CHX, 终浓度为100μg /mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。
（3）离心收集细胞后，加入预冷的PBS (0.01M，含100μg /mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。
注意事项：
- 胰酶：①分装多瓶备用，避免一瓶反复冻融使用；②消化时防止污染；③消化时间不宜过长；④37℃酶活性最强 ；⑤可选用含血清培养液终止消化。
- CHX：处理细胞的胰酶与PBS中也要加放CHX。
- 建议用尖底的冻存管，便于离心收集沉淀。
- 建议液氮速冻时间5min以上,再转移到-80冰箱。
- 为确保实验的顺利，强烈建议同一样品准备2份，以防部分样品降解时，还需重新取材、制备或送样，耽误宝贵时间。
- 收样的细胞，如无特殊要求，需保证细胞处于指数生长期，细胞不能长的太满，贴壁细胞最多生长到90%左右密度，悬浮细胞最高生长到最高密度的80%左右。
外周血中，外周血单个核细胞（PBMC）在机体免疫中发挥了极其重要的作用。将血液中多核细胞和红细胞去除后，可分离出PBMC，从而能够方便地模拟体外的血液免疫环境。PBMC的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，其比重为1.070左右，而红细胞和多核白细胞的比重超过1.080。通过利用介于两者比重之间的溶液(分层液或密度梯度分离液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与PBMC分离。具体操作如下：
1. 使用EDTA抗凝管（BD，0202992058）采集6 mL外周血。
2. 将新鲜血液转移到15 mL离心管中，室温2000rpm离心10min。
3. 用1mL移液器小心将上层血清吸出。
4. 将上述已去血清后的血液用生理盐水按照1:1（体积比）进行稀释，轻轻吹打3-5次混匀。
5. 将Ficoll试剂充分震荡，上下颠倒5-10次混匀，分装到15ml离心管中（Ficoll溶液与稀释后的血液体积比为3:4），竖直放置到水平台面上静止备用。
6. 将稀释好的血液用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含Ficoll溶液的离心管中。（Ficoll溶液与稀释后的血液体积比为3:4）
7. 将离心管小心缓慢转移至离心机中，尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层。室温400×g，升降速为1，离心30分钟。
8. 离心结束后分4层，由下到上分别为红细胞、Ficoll溶液、淋巴细胞层、生理盐水。
9. 用移液枪吸取一部分生理盐水，将枪头插进淋巴细胞层中小心吸取，转移至新的15 mL离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞造成污染。
10. 加入10mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，室温100×g，离心10min 。
11. 弃上清，加入1mL红细胞裂解液，裂解3min。室温300×g，离心5min。
12. 弃上清，加入10mL生理盐水轻轻吹打混匀，室温100×g，8min离心。重复2次。
13. 弃上清，用1640完全培养基重悬细胞，加入(CHX, 终浓度为100μg /mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。
14. 同时取样进行台盼蓝染色，看细胞活率、细胞浓度。
15. 离心收集细胞后，加入预冷的PBS (0.01M，含100μg /mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。
2.4 组织样品 (>100mg)
2.4.1动物组织
2.4.1.1斑马鱼胚胎
- 当胚胎处于适当的阶段，去除绒毛膜(或手动或按标准方案使用pronase)。
- 室温下E3培养基清洗2次。
- E3培养基中加入CHX(100µg/mL)，室温下孵育胚胎5分钟。
- 用移液器将胚胎转移到冰上的epppendorf试管中。
- 在液氮中快速冷冻，在-80℃保存。
- 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
2.4.1.2哺乳动物组织
注意：翻译是高度动态变化的，对内部和外部信号都有快速的反应。为了准确测量整个组织的体内翻译情况，必须尽快切除并快速冷冻相关组织，最大限度地减少了核糖体从转录本上脱落而引起的翻译变化。
（1）准备必要的手术工具，确保操作环境无RNase，备好液氮。
（2）按照实验室的标准程序，迅速处死动物并摘取目的组织。
（3）用高压灭菌后的无RNase PBS清洗组织，去除多余的结缔组织血液。
（4）在液氮中快速冷冻组织，冷冻后碾磨成粉末转移冻存管。
（5）-80度保存，干冰运输。
2.4.2植物组织（100mg）
（1）准确取得所需组织后，立即用准备好的铝箔包裹组织。
（2）立即投入液氮冷冻,冷冻后碾磨成粉末转移冻存管，-80度保存，干冰运输。
（3）填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
- 注意事项
包裹组织的铝箔或冷冻保存管转入样本袋时，请按以下步骤进行：把样本袋（纱布袋）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷冻的组织放入样本袋（每个样本袋只保存同样的组织，样本较多时应分装至多个小袋，不要在一只样本袋中放过多的样本以防无法放入液氮罐或无法送液氮罐取出），袋口留一根编号绳，绳上粘两张标签纸（标签上注明：客户名、样本名称、编号、日期，粘2 张标签纸是为了防止标签脱落造成样本混乱），迅速转入液氮罐。
2． 如使用广口容器液氮暂存
建议用进口高质量冻存管，油性笔标记后，样品迅速放入管中，拧紧后迅速放入液氮中。然后再转移到超低温冰箱中保存。
3． 直接干冰中保存并快递的
建议全部用进口冻存管，油性笔标记后，样品迅速放入经干冰预冷的冻存管中，放入样品袋，埋入干冰中，密封包装后，运输。
不要用国产冻存管，因为国产冻存管从液氮中取出时也常发生爆裂，可能造成样品损失或伤人。
4. 处于不同发育阶段以及不同生长条件的样本中所含有的RNA 的量是不同的，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中RNA 的量可能与常规相应样本有显著的差异。存储条件以及存储时间也是影响RNA 得率的关键因素，一般来说从新鲜的样本中总是能够的到预期的RNA 产量，但是没有保存在液氮或者-80℃冰箱中的样品是不可靠的。即使是保存在液氮或者-80℃冰箱中的样品，如果存储时间过长，RNA 产量也会显著降低。因此，实验中组织的需要量只能以实际抽提结果为准。
强烈建议：
为确保实验顺利，我们强烈建议您在取样时，应同时备份2-3 份，如备份3 份，则送给我们两份，如备份2 份，则送样一份，您自己留一份，以防备部分样品降解，重新取材或送样将耽误您的时间。即使样品全部合格，备份的样品您还可以用来进行其他方面的实验（如定量验证、蛋白方面，生化方面的实验等）。
备份又分为两种，一种为严格备份，即：样品取下后一分为二，这样的两份样品基本上具备同性质。另一种为非严格备份，即生物学重复的样品，这样的备份样品同质性要较前者差。
参考文献：
This protocol is an updated version of the protocol posted by Huili Guo (8/8/10), which detailed the approach she used for ribosome profiling and mRNA-seq in Guo et al., Nature 466: 835–840 (2010); available at http://bartellab.wi.mit.edu/protocols.html.