导读：
Polysome profiling分析利用蔗糖梯度超离心分离翻译过程中mRNA复合体和蛋白质。在这里，我们给大家奉上两篇经典文献，文中分别提供了从蔗糖密度梯度中分离出的组分进行RT-qPCR分析时如何设置参照基因的具体方案。在这里摘抄出来，供大家参考。
外参法：

各组分中RNA的提取与定量
本方案包括从梯度组分中提取RNA，然后进行逆转录和定量PCR (RT-qPCR)、qPCR数据处理。其中引入了荧光素酶RNA（FLuc RNA）做标准化。

(4) qPCR数据分析


在所有组分中检测到的目的转录本的总数设置为100%，每个组分中目的转录本的比例用百分比表示。
示例：


内参法

该研究是通过悬浮细胞系中的多核糖体分析来筛选潜在的微肽编码 lncRNA。当与定量PCR相结合，有助于同时识别许多翻译lncRNA。

作者在完成polysome分离后，对各组分进行了RNA提取和cDNA反转录。在通过 RT-qPCR筛选可能翻译的lncRNA时，设置了阳性和阴性对照，以评价结果的稳健性。GAPDH等管家基因的mRNA可作为阳性对照；已知的细胞质非编码RNA，如hY1，可以作为阴性对照。GAPDH的峰值应位于高多核分数中，而hY1应富集在亚单体分数中。在 polysome分数中具有突出峰值的候选lncRNA可能表明在细胞中激活翻译。


量化和统计分析
每个组分中RNA百分比的计算如下：

X = 计算的分数；Y= 分数总数。


参考文献：
Pringle ES, McCormick C, Cheng Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Curr Protoc Mol Biol. 2019 Jan;125(1):e79. doi: 10.1002/cpmb.79. Epub 2018 Oct 29. PMID: 30371019.
Han C, Sun L, Pan Q, Sun Y, Wang W, Chen Y. Polysome profiling followed by quantitative PCR for identifying potential micropeptide encoding long non-coding RNAs in suspension cell lines. STAR Protoc. 2021 Dec 14;3(1):101037. doi: 10.1016/j.xpro.2021.101037. PMID: 34977682; PMCID: PMC8683657.